Functional analysis of variant proteins in Plasmodium vivax: Implications in pathology

Tesi realitzada al Centre de Recerca en Salut Internacional de Barcelona (CRESIB) - Hospital ClínicP. vivax is the most widespread malaria, it accounts for 25-40% of the global disease burden and it is estimated that causes from 132 to 391 million clinical cases each year. It is amply accepted that P. vivax do not cytoadhere to the inner capillaries having an obligate passage through the spleen. Our group advanced a hypothesis postulating that this parasite induces a reorganization of the spleen and the formation of a barrier of fibroblastic origin where infected reticulocytes specifically cytoadhere through VIR proteins. The VIR multigene subtelomeric family encodes for 346 genes and is divided into 12 different subfamilies. Despite they were originally located at the surface of infected reticulocytes; motif analysis suggested that they could present different subcellular localizations and exert different functions. In the absence of a long term P. vivax in vitro culture, we generated P. falciparum transgenic lines expressing VIR proteins from subfamily A (vir17), C (vir14) and D (vir10). Immunofluorescence assays revealed that they presented different subcellular localizations when expressed in P. falciparum. While VIR14 and VIR10 were exported to the membrane of the infected erythrocyte, VIR17 remained inside the parasite and was located surrounding the membrane in nascent merozoites. Later, a new clustering approach redefined the VIR repertoire and confirmed that members of subfamily A could no longer be considered VIR proteins, as well as members of subfamily D and H. Cytoadhesion assays revealed that VIR14, expressed in the surface of P. falciparum infected erythrocytes , mediated cytoadherence to CHO cells expressing endothelial receptors CD36, ICAM-1, VCAM and E- Selectine. However, only significant cytoadhesion levels to ICAM-1 were maintained under flow conditions. In addition, the transgenic line expressing VIR14 presented high adhesion to spleen fibroblasts. Similar adhesion levels were reported in some isolates of P. vivax infected reticulocytes. Finally, adhesion-inhibition experiments, using specific polyclonal antibodies against conserved motifs of VIR proteins, revealed that these proteins mediated adhesion to spleen fibroblasts whereas ICAM-1 was not the main receptor involved in this adhesion. Collectively, the data presented here suggest that VIR proteins mediate cytoadhesion in P. vivax and could have and important role in avoiding parasites spleen clearance.Plasmodium vivax és el paràsit causant de la malària humana amb distribució geogràfica més àmplia i s’estima que cada any produeix de 132 a 391 milions de casos clínics. Sempre s’ha cregut que P. vivax no citoadhereix als capil•lars interns dels òrgans i que per aquest motiu té un pas obligat per la melsa, però encara es desconeix com el paràsit és capaç d’evitar l’eliminació per part d’aquest òrgan. El nostre grup va postular que el paràsit indueix la reorganització de la melsa, mitjançant la formació d’una barrera d’origen fibrocític a la que el paràsit s’adhereix mitjançant les proteïnes VIR. La família multigènica VIR va ser descoberta pel nostre grup i presenta 346 gens que es divideixen en 12 subfamílies diferents. Els darrers anàlisis bioinformàtics van demostrar que podrien tenir localitzacions sub-cel•lulars diferents i exercir diferents funcions. Degut a la impossibilitat de cultivar aquest paràsit, en aquesta tesi s’han generat línies transgèniques de P. falciparum expressant gens vir de la subfamília A (vir17), C (vir14) i D (vir10). Els assajos d’immunofluorescència han revelat que aquestes proteïnes, quan s’expressen en P. falciparum presenten localitzacions sub-cel•lulars diferents. No obstant, l’aplicació posterior d’un nou algoritme va determinar que els membres de les subfamílies A i D ja no poden ser considerades VIR, juntament amb la subfamília H. En paral•lel, es van realitzar assajos de citoadhesió que van revelar que el VIR14, que s’expressa a la superfície de l’eritròcit, presenta adhesió a cèl•lules CHO que expressaven diferents receptors endotelials humans. No obstant, quan els assajos van ser realitzats en condicions de flux, només es va mantenir l’adhesió a ICAM-1. A més a més, assajos posteriors van demostrar que la línia transgènica que expressa el VIR14 presenta una gran adhesió a fibroblasts de melsa. Per extrapolar aquests resultats, vam realitzar assajos utilitzant soques de camp de P. vivax que van mostrar nivells d’adhesió variables a fibroblasts de melsa i van suggerir que les proteïnes VIR poden estar implicades en aquesta adhesió. En resum, les dades presentades en aquesta tesi suggereixen que les proteïnes VIR són almenys en part, les responsables de la citoadhesió del paràsit evitant així l’eliminació per part de la melsa