Adaptaçao de anemonas do mar a variaçao de salinidade : evidencias de mecanismos regulatórios

Orientadora: Marta Marques de SouzaDissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçao em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 14/02/2006Inclui bibliografiaÁrea de concentraçao: FisiologiaActinia bermudensis e Bunodosoma caissarum são duas espécies de anêmonas do mar que vivem associadas ao substrato rochoso na zona entre marés. Por serem funcionalmente sésseis e, portanto, incapazes de escapar de situações desfavoráveis que acontecem nessa região, elas devem realizar ajustes intracelulares de modo a compensar as variações osmóticas do meio. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi estudar os mecanismos envolvidos com o equilíbrio osmótico e iônico desses animais durante a adaptação a variação de salinidade. Para tanto, exemplares das duas espécies foram expostos por 6 horas a um choque hiposmótico (25‰), a situação controle (30‰) e a um choque hiperosmótico (37‰). Após a exposição, foi dosado a osmolalidade, os íon Na+, K+ e Cl- e as NPS (substâncias positivas à ninidrina) no fluido do celêntero. Também foram dosados os mesmos íons e o teor de NPS no músculo, além do teor hídrico tecidual. Com base nos resultados das variações da osmolalidade e dos osmólitos analisados, foram definidas as soluções experimentais para a análise do volume em células isoladas. Assim foram preparadas uma solução controle (975 mOsm), uma solução hiposmótica (785 mOsm) e uma solução hiperosmótica (1225 mOsm), também foram preparadas, essas mesmas soluções sem Ca2+, para avaliar a participação desse íon como sinalizador do processo regulatório. As células foram dissociadas por método enzimático e então expostas às diferentes condições experimentais, a análise do volume celular foi realizada em microscópio invertido num intervalo de tempo de 20 min. As imagens foram capturadas através de uma câmera digital (Moticam 480) e submetidas à análise de imagens (Motic Images 2000 -1.3). A variação do diâmetro celular foi medida e então convertida para volume celular. Também foram testados alguns bloqueadores das principais vias de transporte envolvidas na regulação de volume celular. Associados ao choque hiposmótico foram testados a ouabaína, o DIDS, furosemide (3mM) e HgCl2, para o choque hiperosmótico, foram testados ouabaína, furosemide (100µM), amiloride e DIDS. Os resultados do ensaio in vivo demonstram que Actinia bermudensis osmoconforma em ambas as salinidades, enquanto Bunodosoma caissarum osmorregula em 25‰ e osmoconforma em 37‰. A análise dos osmólitos extracelulares e teciduais indica que Actinia bermudensis é um típico osmoconformador e que utiliza osmólitos orgânicos associados aos inorgânicos para regulação de volume celular quando em choque hiposmótico. Enquanto Bunodosoma caissarum osmorregula em 25‰, pelo aumento de osmólitos orgânicos, e mantém seu volume celular por liberação de osmólitos inorgânicos e orgânicos, e em 37‰ parece apresentar mecanismos para acúmulo iônico celular. Já os resultados dos ensaios in vitro evidenciam uma regulação completa de volume celular de Bunodosoma caissarum e uma regulação parcial de volume de Actinia bermudensis durante a exposição das células ao choque hiposmótico. Não foi evidenciada regulação de volume celular durante o choque hiperosmótico em nenhuma das duas espécies. Bunodosoma caissarum aparentemente regula volume celular diante de hiposmoticidade pelo efluxo de íons através do contransportador K+-Cl+ e possivelmente pelo efluxo de osmólitos orgânicos que utilizam vias aniônicas de transporte. A participação de Ca+ como sinalizador do processo regulatório, só pôde ser evidenciada em células de Bunodosoma caissarum quando exposta ao choque hiposmótico. Palavras chave: Actinia bermudensis, Bunodosoma caissarum, hiposmótico, hiperosmótico, volume celularActinia bermudensis and Bunodosoma caissarum are two anemone species that live on rocky substrate in intertidal zones, being functionally sessile, they are not able to escape from difficult situations typical of these areas. These species need intracellular adjustments to compensate for environmental osmotic variations. The purpose of this study was to investigate the mechanisms involved in the osmotic and ionic equilibrium of these species during adaptation to salinity. For this purpose, animals of the two species were exposed for 6 h to a hyposmotic shock (25‰), control salinity (30‰) and hyperosmotic shock (37‰), after which was measured the osmolality, the ions Na+, K+ e Cl- and the NPS (ninhydrin positive substances) on the coelenteron fluid. Also, was meansured the same íons, the NPS and the water content of the muscle. Based on the results of osmolality variation and the analyzed osmolytes, it was defined the experimental solutions to single cell volume analysis. Thus, was prepared an isosmotic saline (975 mOsm), hyposmotic (785 mOsm) and hyperosmotic (1225 mOsm) saline, also was prepared the same salines free of Ca²+, to evaluate this ion’s role in signaling of the regulatory process. The cells were dissociated by enzymatic methods and exposed to different experimental conditions, for 20 min. The cellular volume analysis was performed on an inverted microscope, using a digital camera to capture the images. The diameter of the cells were taken and converted to volume. Also, the presence of blockers of the main transport pathways involved in cellular volume regulation was evaluated. Associated with hyposmotic shock: ouabain, DIDS, furosemide (3mM) and HgCl2, to hyperosmotic were tested: ouabain, furosemide (100µM), amiloride na DIDS. The in vivo results show that Actinia bermudensis osmoconforms in both salinities, while Bunodosoma caissarum osmorregulates in 25‰ e osmoconforms in 37‰. The tissue and extracellular osmolytes analysis indicate that Actinia bermudensis is a typical osmoconformer, using organic and inorganic osmolytes for cellular volume regulation when under hyposmotic shock. While Bunodosoma caissarum osmorregulates in 25‰, by increasing organic osmolytes, maintaining its cell volume by the release of organic and inorganic omolytes, and in 37‰ seems to present mechanisms of ion accumulation. The in vitro assays revel a complete cell volume regulation in Bunodosoma caissarum and a partial regulation in Actinia bermudensis during the cell exposure to hyposmotic shck. During hyperosmotic schok, cellular volume regulation was not observed in either species. Bunodosoma caissarum aparently regulates cell volume under hyposmoticity by ionic efluxes through K+-Cl+ cotrnasporter and possible by organic osmolytes throug anion pathways. The analysis of the role of Ca+ in the regulatory processes indicates that only the activation of osmolytes release from Bunodosoma caissarum cells under hyposmotic shock is mediated by extracellular Ca²+