Extrato, purificação, caracterização e atividade anticoagulante e antitrombótica de glicosaminoglicanos de vísceras de peixes (Oreochromis niloticus e Piaractus mesopotamicus)

Orientador : Prof. Dr. Thales Ricardo CiprianiCoorientadores: Prof. Dr. Guilherme L. Sassaki, Prof. Dr. Marcello IacominiTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências - Bioquímica. Defesa : Curitiba, 31/10/2017Inclui referênciasResumo: Glicosaminoglicanos (GAGs) são uma importante família de polissacarídeos aniônicos. Cada tipo de GAG apresenta diferente densidade de carga negativa em sua estrutura e isso faz com que eles apresentem propriedades estruturais e biológicas distintas. Com exceção do ácido hialurônico, todos os GAGs ocorrem nos tecidos como proteoglicanos, glicoconjugados encontrados principalmente na superfície celular e na matriz extracelular. Os GAGs estão presentes em todo o reino animal e em peixes eles já foram confirmados por alguns pesquisadores. Em 2015 o Brasil foi responsável pela produção de 219 mil toneladas de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) e cerca de 13 mil toneladas de pacu (Piaractus mesopotamicus). Junto com essa produção existe a geração de resíduos que podem se tornar matéria prima para a extração e isolamento de GAGs com potenciais aplicações. Com isso, nosso objetivo foi extrair, isolar, caracterizar e determinar possíveis atividades farmacológicas de GAGs obtidos de vísceras dos peixes Tilápia do Nilo (T) e Pacu (P), criados na região oeste do Paraná. As vísceras foram deslipidificadas e submetidas à proteólise, seguida de filtração. Após, o filtrado foi tratado com etanol para a precipitação da fração bruta de GAGs os quais foram fracionados por cromatografia de troca aniônica e, então, submetidos à tratamento com condroitinase. Foram obtidas as frações P-1.0R e T1.0R (constituídos de dermatam sulfato), P-0.75R e T-0.75R (constituídos por mistura de dermatam sulfato e heparan sulfato) e P-0.75B, P-0.75C e T-0.75B (constituídos por mistura de dermatam, condroitim e heparam sulfato). Uma vez que diversos GAGs comumente apresentam atividade anticoagulante, esta propriedade foi investigada para as frações de GAGs obtidas a partir de tilápia e pacu. Todas as frações foram capazes de prolongar o aPTT em ensaio realizado com plasma ovino, demonstrando assim efeito anticoagulante, com as amostras de tilápia apresentando melhores efeitos. Também foi demonstrado que a atividade anticoagulante das frações está relacionada à inibição da atividade das enzimas a-trombina e fator Xa da cascata de coagulação, de maneira dependente de antitrombina e cofator II da heparina. Além disso, foi verificado efeito antitrombótico in vivo para todas as frações de GAGs, com T-0.75A apresentando a melhor atividade, inibindo em quase 100% a formação de trombo, na dose de 1 mg/kg. Desta forma, neste estudo foi comprovada a presença de diferentes GAGs nas vísceras de tilápia e pacu, que apresentam atividades anticoagulante e antitrombótica, mostrando que as vísceras destes peixes podem ser utilizadas para a obtenção de compostos com potencial aplicabilidade.Abstract: Glycosaminoglycans (GAGs) are an important family of anionic polysaccharides. Each type of GAG presents a different density of negative charge in its structure and this is related to their different biological structures and properties. Except for hyaluronic acid, all GAGs are present in tissues in the form of proteoglycans, which are glycoconjugates found in the cell surface and in the extracellular matrix. GAGs are present throughout the animal kingdom, and in fish they have already been confirmed by some researchers. In 2015, Brazil was responsible for the production of 219 thousand tons of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) and about 13 thousand tons of pacu (Piaractus mesopotamicus). With this production there is the generation of waste that can become raw material for the extraction and isolation of GAGs with potential applications. Therefore, the objective of this work was to extract, isolate, characterize and determine possible pharmacological activities of GAGs obtained from viscera from Nile tilapia (T) and Pacu (P), grown in the western region of Paraná. The viscera were delipidified and submitted to proteolysis, followed by filtration. Then, the filtered part was treated with ethanol to precipitate the crude GAGs fraction, which had been obtained by anion exchange chromatography and treated with chondroitinase. Fractions P-1.0R and T1.0R (consisting of dermatan sulfate), P-0.75R and T-0.75R (consisting of a mixture of dermatan sulfate and heparan sulfate) and P-0.75B, P-0.75C and T-0.75B (consisting of a mixture of dermatan, chondroitin and heparan sulfate) were obtained. Due to GAGs commonly present anticoagulant activity, this property was evaluated for all GAGs fractions obtained from tilapia and pacu. All fractions were able to increase aPTT, in a test performed with ovine plasma, demonstrating anticoagulant activity, with the samples from tilapia showing better effects. It was also demonstrated that the anticoagulant activity of the fractions is related to inhibition of the enzymes of the coagulation cascade, ?-thrombin and factor Xa, in a way dependent of antithrombin and heparin cofactor II. In addition, in vivo antithrombotic effect of all GAGs fractions was observed, with T-0.75A showing the best activity, inhibiting almost 100% thrombus formation at a dose of 1 mg/kg. Thus, in this study the presence of different GAGs in the viscera of tilapia and pacu, which present anticoagulant and antithrombotic activities, has been proven, showing that the viscera from these fish species can be used to obtain compounds with potential applicability. Keywords: Nile Tilapia, Pacu, Chondroitin sulfate, Dermatan sulfate, Heparan sulfate