Regulação pós-traducional da Enzima Nitrogenase em Azospirillum Brasilense

Orientador : Prof. Dr. Luciano Fernandes HuergoCo-orientador : Prof. Dr. Marcelo Muller dos SantosDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 13/02/2012Bibliografia: fls.102-117Resumo: Azospirillum brasilense é um organismo diazotrófico com capacidade de se associar com diversas plantas de interesse econômico. Devido ao custo energético do processo de fixação de nitrogênio, esse processo é altamente regulado a níveis transcricionais e pós-traducionais. Em A. brasilense, a regulação pós-traducional da nitrogenase é realizada pelas enzimas DraG e DraT, que promovem a remoção/adição de um grupo ADP-ribose à proteína NifH, levando ao ligamento/desligamento da mesma. As proteínas PII são proteínas transdutoras de sinais, ubíquas em bactérias. Elas estão envolvidas com a regulação do metabolismo de nitrogênio e atuam principalmente por interação direta com proteínas alvo. Em A. brasilense existem duas proteínas PII denominadas GlnB e GlnZ, que interagem com DraT e DraG, respectivamente, regulando-as. Além disso, proteínas PII podem interagir ainda com a proteína de membrana AmtB em resposta a alteração dos níveis celulares de amônio, que leva a alteração nos níveis intracelulares dos efetores ADP, ATP e 2-OG. Em resposta a essa alteração, GlnZ, DraG e AmtB podem interagir formando um complexo ternário por intermédio de GlnZ. As proteínas PII de A. brasilense apresentam alta similaridade entre si, mas são altamente específicas para suas proteínas alvo, embora as bases estruturais para essa especificidade não sejam bem conhecidas. Desse modo, o objetivo deste trabalho foi determinar motivos estruturais nas proteínas PII responsáveis pela especificidade na interação com as enzimas DraT e DraG em Azospirillum brasilense e investigar como alterações nos níveis celulares de 2-OG e energia influenciam a atividade das proteínas PII neste organismo. DraG, diferentemente das demais proteínas alvo de PII, interage com GlnZ pela região lateral dos trímeros e a especificidade da interação DraG-GlnZ se dá pelos resíduos D68, Q69, Q72, T21 e L23 de GlnZ. A formação dos complexos DraG-GlnZ e AmtB-PII parece ser regulada principalmente pela concentração de 2-OG, que controla a ocupação dos sítios de ligação de efetores por ADP ou ATP. Quando na presença de ADP, DraG, GlnZ e AmtB podem formar um complexo ternário que parece ser o responsável in vivo pela inativação do substrato, mas in vitro, a enzima DraG permanece enzimaticamente ativa mesmo quando complexada a GlnZ ou GlnZ-AmtB, indicando que o complexo não é suficientemente estável para impedir a catálise (remoção ADPR de NifH) e reforçando a hipótese de que o sequestro de DraG para membrana é necessária para inativação de DraG.Abstract: Azospirillum brasilense is a diazotrophic organism with the ability to associate with many plants of economic interest. Due to the energetic cost of nitrogen fixation process, this process is highly regulated at the transcriptional and post-translational levels. In A. brasilense, nitrogenase posttranslational regulation is performed by DraG and DraT, which remove/adds a ADP-ribose to NifH protein, leading to switch on/switch off of NifH. PII proteins are signal transducing proteins, ubiquitous in bacteria. They are involved in the regulation of nitrogen metabolism and act primarily by direct interaction with target proteins. In A. brasilense two PII proteins were indentified, GlnB and GlnZ, that interact with DraT and DraG, respectively, regulating DraT and DraG activities. Furthermore, proteins PII can interact with the membrane protein AmtB in response to variation in cellular levels of ammonium that, in turn, afffect the intracellular levels of the PII effectors ADP, ATP and 2-OG. In response to ammonium, GlnZ, DraG and AmtB interact to form a ternary complex. Despite their high similarity, PII proteins from A. brasilense are highly specific for interaction with their target proteins. The structural basis for such specificity is unknown. The objectives of this study were to determine structural motifs responsible for the ability PII to interact specifically with DraT and DraG in Azospirillum brasilense and also to investigate how changes in the cellular levels of 2-OG and energy can influence the activity of PII proteins in this organism. DraG interacts with GlnZ by the lateral region of the trimer and the specificity of the interaction DraG-GlnZ occurs by residues D68, Q69, Q72, T21 and L23 of GlnZ.The formation of the complexes DraG-GlnZ and AmtB-PII are regulated mainly by the concentration of 2-OG, which controls the occupation of PII proteins by ADP or ATP. In the presence of ADP, DraG, GlnZ and AmtB form a ternary complex that seems to be responsible for DraG inactivation in vivo, however, in vitro, DraG remains enzymatically active even when complexed the GlnZ or GlnZ-AmtB, indicating that the complex is not stable enough to prevent catalysis (removal of ADPR NifH) and supports the hypothesis that the sequestration of DraG to membrane is required for inactivation of DraG