Desenvolvimento de antígenos e anticorpos recombinantes com potencial ao diagnóstico do vírus sincicial respiratório humano

Orientador: Prof. Dr. Marco Aurélio KriegerCoorientador: Prof. Dr. Nilson I. T. ZanchinTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 24/02/2017Inclui referências: p.128-137Resumo: O vírus sincicial respiratório humano (HRSV) é o principal causador de infecções respiratórias agudas, incluindo pneumonia e bronquiolite em recém-nascidos e crianças pequenas; pode acometer também idosos, transplantados e pacientes imunocomprometidos. Atualmente, nenhum tratamento terapêutico eficaz ou vacina contra esta doença está disponível. Sua alta relevância reforça a necessidade do desenvolvimento de um método de diagnóstico que seja capaz de detectar o vírus logo após o surgimento dos primeiros sintomas. Porém, deve-se levar em conta as caracteristicas genéticas, que é um dos fatores limitantes dos ensaios imunológicos de detecção. O HRSV é um vírus RNA(-) de cadeia simples que codifica onze proteínas. Dados da literatura indicam que as proteínas do envelope F1 e G, e a proteína do nucleocapsídeo (N), são as que apresentam maior potencial imunogênico. As sequências codificadoras destas proteínas foram utilizadas na construção de vetores de expressão para obtenção dos seus respectivos antígenos recombinantes em Escherichia coli. Após a purificação por cromatografia de afinidade e troca iônica, estes antígenos foram utilizados para obtenção de anticorpos policlonais em camundongos. Foi produzido também um fragmento sintético de anticorpo do tipo Fab em Pichia pastoris, que reconhece a proteína F1 do HRSV. A capacidade dos anticorpos policlonais e do fragmento Fab para detectar seus respectivos antígenos recombinantes ou nativos em swabs nasofaringeal, foram avaliadas pelos ensaios de ELISA, Luminex e Western blot. Através dos ensaios de ELISA e Luminex não foi possível detectar os antígenos vírais nas amostras clínicas para nenhuma das condições testadas. Porém, nos ensaios de Western blot foi possível detectar tanto o antígeno F1 recombinante quanto os antígenos nativos, quando presentes nas amostras clínicas. Este ensaio demonstrou que o fragmento Fab recombinante está funcional e que possui a mesma capacidade para reconhecer o antígeno que o anticorpo monoclonal completo, o qual foi usado como referência nos experimentos. O fragmento Fab pode ser usado eficientemente em muitos tipos de testes diagnósticos baseados na captura de partículas virais, que são os recomendados para a fase aguda desta infecção. Palavras-chave: HRSV. Fragmento Fab. Imunodiagnóstico. Detecção de antígenos.Abstract: The human respiratory syncytial virus (HRSV) is the main cause of acute respiratory infections, including pneumonia and bronchiolitis in infants and young children, but can also affect vulnerable adults, elderly, transplanted and immunocompromised patients. Currently, no effective treatment or vaccine against this disease is available, and its high relevance enforces the necessity of the development of a diagnostic method capable of detecting the virus, as soon as the first symptoms appear and according to its genetic characteristics, which is one of the limiting factors of immunological detection assays. HRSV is a single stranded RNA(-) virus encoding only 11 proteins. The literature indicates that the envelope proteins F1 and G and the nucleocapsid protein (N) are the major immunogenic proteins. The coding sequences of these proteins were used to construct expression vectors from which their respective recombinant antigens were produced in Escherichia coli. After purification affinity and ion exchange chromatography, these antigens were used to obtain polyclonal antibodies in mice. A synthetic fragment of a Fab-type antibody that recognizes HRSV F1 protein was also produced in Pichia pastoris. The capacity of the polyclonal and the Fab fragment to detect their respective recombinant or native antigens, from nasopharyngeal swabs, was evaluated by ELISA, Luminex system and Western blot assays. The ELISA and Luminex assays fail to detect the viral antigens in the clinical samples in all tested conditions. However, with Western blot assays, it was possible to detect both, the recombinant F1 and the native antigens when present in the clinical samples. Through these assays it was possible to demonstrate that the recombinant Fab fragment is functional and has the same ability to recognize antigens as the complete monoclonal antibody, which was used as a control in the experiments. This fragment can be efficiently used in many types of diagnostic tests based on the capture of viral particles which are recommended for the acute phase of infection. Key-words: HRSV. Fab fragment. Immunodiagnosis. Antigen detection