Caracterização molecular das fasinas e outras proteínas associadas aos grânulos de Polihidroxibutirato em Herbaspirillum Seropedicae

Orientadora : Profa. Dra. Leda Satie ChubatsuCo-orientador : Prof. Dr. Marcelo Muller dos SantosDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 14/02/2012Bibliografia: fls. 61-76Resumo: O polihidroxibutirato é um polímero sintetizado por algumas bactérias quando em presença de grande aporte de carbono e deficiência de algum outro elemento essencial ao crescimento. É uma forma de reserva energética e é acumulado sob a forma de inclusões citoplasmáticas insolúveis. Sua síntese leva a associação de proteínas à sua estrutura, muitas envolvidas com a biossíntese e estrutura do grânulo. Das proteínas associadas ao grânulo a fasina é a mais abundante e tem um importante papel estrutural na manutenção da forma e tamanho dos grânulos. O presente trabalho teve por objetivo analisar as proteínas associadas aos grânulos de PHB de H. seropedicae, e também caracterizar as fasinas de H. seropedicae. Para análise das proteínas associadas aos grânulos, os mesmos foram extraídos da bactéria e suas proteínas associadas separadas por eletroforese e identificadas por espectrometria de massa. Dez proteínas consideradas as mais abundantes associadas aos grânulos de PHB foram identificadas: entre essas a fasina PhaP1, a regulatória PhbF e a PhbC sintase. Proteínas aparentemente não envolvidas com o metabolismo de PHB também foram identificadas como aconitase, leucil aminopeptidase, proteína tipo-histona e proteínas hipotéticas. A fim de verificar o papel das fasinas no metabolismo de PHB, mutantes para os genes phaP1, phaP2 e phbC1 foram construídos. Nossos resultados mostram que ambas fasinas têm a capacidade de se ligarem ao grânulo de PHB, e também que a expressão das mesmas só ocorre quando o PHB é sintetizado. No entanto, a expressão de PhaP2 só acontece na ausência de PhaP1 sugerindo diferenças na ativação da transcrição dos genes phaP1 e phaP2 por fatores ainda desconhecidos.Abstract: The polyhydroxybutyrate (PHB) is a polymer produced by some bacteria in both carbon excess and deficiency in other essential element. PHB works as an energetic reservoir and it is stored intracellularly in the form of granules. On the surface of PHB granules, some proteins are attached being important for the structure of the granules and metabolism of PHB. The phasin is the most abundant granule-associated protein and, it has an important structural role controlling the shape and size of granules. In this work, we present the identification of PHB granule-associated proteins from Herbaspirillum seropedicae, as well as the characterization of the phasins from this organism. In order to analyse the granule-associated proteins, PHB granules were extracted from bacterial culture and the proteins coating the granules were separated by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis and identified by mass spectrometry. The 10 more abundant proteins were identified. Among them, the phasin PhaP1, the regulatory protein PhbF and the PHB synthase, PhbC1. Proteins apparently not involved with PHB metabolism were also identified, like aconitase, histone-like protein, leucyl aminopetidase and hypothetical proteins. Aiming to verify the role of phasin in PHB metabolism, phaP1, phaP2 and phbC1 mutant strains were constructed. Our results showed that both phasins have the capability to bind PHB granule and also, the expression of them occurred only in PHB biosynthesis conditions. Interestingly, PhaP2 was only expressed when PhaP1 was absent, suggesting that the transcriptional regulation of phaP2 might involve other unknown factors