Desenvolvimento de ensaio imunoenzimatico para determinação do hormônio do crescimento humano

Orientador: Bonald C. de FigueiredoCo-orientador: Vânia M. de AlcântaraDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da SaúdeResumo: O procedimento usual para se confirmar uma suspeita clínica de deficiência do hormônio do crescimento (GHD) é verificar se existe ausência de um pico mínimo de GH (7 ng/ml) nos testes de estímulos farmacológicos com insulina ou clonidina. Além da falta de consenso internacional sobre o valor a ser adotado para o pico mínimo de GH, atualmente variando entre 5 e 10 ng/ml, há também as diferenças existentes entre os diversos imunoensaios empregados, sobretudo em relação à especificidade do anticorpo de captura empregado em cada imunoensaio. Desta forma, foi proposto um ELISA sanduíche com o objetivo de quantificar as isoformas do hGH que possuem o sítio 1 de ligação ao receptor somatogênico. Para este fim, anticorpos policlonais de cavalo anti-hGH recombinante (rhGH) foram produzidos, purificados em coluna de afinidade com rhGH ligado covalentemente à sefarose e, em seguida, divididos em dois grupos através da utilização de uma segunda coluna de afinidade, contendo parte da hélice 4 do hGH ligada à sefarose. Os anticorpos aderidos nesta coluna foram posteriormente eluídos com solução ácida e utilizados como anticorpos de "captura", ao passo que os anticorpos que não ficaram retidos durante a passagem pela segunda coluna foram conjugados à Horseradish Peroxidase (HP) e usados como segundo anticorpo ou de marcação. Anticorpos anti-hélice 4 foram incubados numa placa, 1 }ig/poço, como antígeno, utilizou-se o rhGH em concentrações de 125 a 0,98 ng/ml e o segundo anticorpo, conjugado à HP em diluição de 1:1000. Verificou-se que a faixa de linearidade mais adequada para leitura de amostras desconhecidas esteve entre 1,95 e 31,25 ng/ml de rhGH e que a sensibilidade mínima testada foi de 0,12 ng/ml. O coeficiente de variação intra-ensaio foi de 4,53 e de 6,33 % para os respectivos valores de 8,16 e de 2,37 ng/ml, enquanto o coeficiente de variação interensaio foi de 6,00 e 8,27% para as concentrações de 8,67 e 14,87 ng/ml, respectivamente. As percentagens de recuperação variaram entre 96,02 e 103,82% enquanto a linearidade mostrou-se mais satisfatória para concentrações de hGH acima de 3,37 ng/ml. A especificidade do anticorpo foi avaliada utilizando-se concentrações de até 500 ng/ml do hormônio homólogo, prolactina humana, sem apresentar reação cruzada, afastando resultados de falsa imunorreatividade. Comparando-se o ELISA sanduíche com o IRMA, na quantificação de hGH de 436 amostras de 73 meninos e 36 meninas submetidos aos testes de estímulo com clonidina, verificou-se que as maiores discrepâncias aconteceram com valores abaixo de 2 e acima de 20 ng/ml. Vinte e quatro amostras com determinações diferentes entre estes dois ensaios foram submetidas ao ensaio quimioluminescente e, apesar dos resultados não terem sido semelhantes, houve boa correlação entre o ELISA e o IRMA, cujo coeficiente foi de 0,90 e entre o ELISA e o ICMA foi de 0,93, ao passo que entre o ICMA e o IRMA foi de 0,89. As características deste ELISA sanduíche permitem a sua utilização na determinação de hGH na rotina laboratorial de pacientes com GHD, porém, para que seja aplicado em pesquisas na quantificação de concentrações mais baixas de hGH, seriam necessários estudos adicionais.Abstract: The usual procedure to confirm a suspicious clinical case of growth hormone deficiency (GHD) is to verify whether exist or not a minimal GH peak (7 ng/ml) on pharmacological tests with insulin or clonidine. Lack of an international consensus about the minimal peak of GH, presently ranging from 5 to 10 ng/ml, and all technical differences among available immunoassays, specially related to the capture antibody specificity contribute to divergent results among these assays. Thus, the present study was designed to prepare a sandwich ELISA to quantify all hGH isoforms that present binding site 1 to its receptor. To this end, horse policlonal, anti recombinant hGH (rhGH) were produced and purified in affinity columns prepared with rhGH covalently bound to sepharose. The obtained antibodies were further splitted into two groups through a second affinity column prepared with a synthetic peptide correspondent to a fraction of helix 4 bound to sepharose. The antibodies retained to the second column were afterwards eluted with acidic solution and used as capture antibodies, while those with free passage through the column were conjugated to Horseradish Peroxidase (HP) and used as second or marker antibodies. One microgram of anti-helix 4 antibody was incubated in each well, with rhGH concentrations ranging from 125 to 0.98 ng/ml and second antibody, conjugated to HP, applied in a 1:1000 dilution. The working range was observed between 1.95 and 31.25 ng/ml of rhGH and the minimal tested sensibility was 0.12 ng/ml. The intra-assay variation coefficient was 4.53 and 6.33 % for rhGH values of 8.16 and 2.37 ng/ml, respectively, while the inter-assay variation coefficient was 6.00 and 8.27% for rhGH concentration of 8.67 e 14.87 ng/ml, respectively. Rate of recovery ranged between 96.02 and 103.82%, however, the best linearity (closer to 100%) was noticed for hGH above 3.37 ng/ml. Antibody specificity was evaluated incubating up to 500 ng/ml of the GH homologous hormone, prolactin, without presenting any cross-reactivity, what ruled out false immunoreactivity to hGH. Comparisons between sandwich ELISA and IRMA were made during hGH quantification of 436 samples from 73 boys and 36 girls submitted to provocative tests with clonidine and some discrepancies were found for hGH below 2 and above 20 ng/ml. Twenty four divergent samples between ELISA and IRMA were further analyzed with a immunochemiluminometric assay (ICMA), which exhibited results different from those obtained with ELISA and IRMA. However, the correlation coefficients found between ELISA and IRMA was 0.90, between ELISA and ICMA was 0.93 and between ICMA and IRMA was 0.89. The observed features of the present ELISA allow its use for determination of hGH required by routine analyses of patients with GHD, however for research purposes requiring measurements of low concentrations of hGH further optimization of this assay is necessary