Identificação de marcadores moleculares em metástases de linfonodos sentinela mamários

Orientador : Prof. Dr. Iglenir João cavalliCoorientadoras: Profa. Dra. Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro, Profa. Dra. Luciane Regina CavalliTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 30/09/2011Bibliografia: fls. 113-137Área de concentração: GenéticaResumo: O câncer de mama é considerado uma das principais doenças potencialmente letais em mulheres. Atualmente, seu prognóstico é baseado em fatores histopatológicos e clínicos, sendo que a identificação de células tumorais nos linfonodos axilares é o fator prognóstico mais eficaz. O linfonodo sentinela (LNS) é o primeiro da linhagem linfática a apresentar células malignas nos cânceres de mama que metastatizam. Sua positividade é um indicativo para o esvaziamento axilar completo. Apesar dos avanços na biópsia do LNS, ainda há um grande número de resultados falso-positivos e falso-negativos. Portanto, a avaliação precisa do LNS, capaz de identificar até o menor foco metastático, é essencial antes da realização do esvaziamento axilar. O objetivo principal deste estudo é identificar a presença de alterações de número de cópias de DNA em diferentes regiões do genoma humano em metástases nos LNS, em comparação com os tumores primários (TP) de mama correspondentes. Amostras pareadas de TP e LNS foram analisadas através dos métodos de CGH (30 pares) e CGH-array (10 pares). Para validação do CGH-array, foram realizados os métodos de FISH (genes BP1 e HER2) e PCR em tempo real para número de cópias de DNA (genes AKT1, AKT2, BP1, FGFR2, HER2, PIK3CA e PTEN). Observamos, por CGH e CGH-array, mais ganhos do que perdas de material genético. Os principais ganhos, observados por CGH foram em 1p, 1q, 6p, 11p, 16, 17, 18q, 19, 20, 21 e 22. As perdas cromossômicas foram observadas principalmente em 1p, 2q, 4q, 6q, 12q, 13q, 18q e Xq. Por CGH-array, as alterações cromossômicas mais freqüentes, incluindo amplificações e deleções, ocorreram em 1q, 8q, 10q, 11q, 14q, 16p, 17q, 20q, 21q e Xq. A análise de FISH validou os resultados de CGH-array em 65% dos casos para o gene BP1 e 55% dos casos para o gene HER2. A validação por PCR em tempo real foi mais concordante para os genes BP1 (70,1%) e HER2 (64,7%), seguida pelos genes AKT2 (41,2%), AKT1 e FGFR2 (29,4% cada), PIK3CA (25,0%), e PTEN (11,8%). CGH e ou CGH-array são métodos muito sensíveis para a avaliação do número de cópias de DNA, podendo auxiliar na identificação de células tumorais no LNS. As alterações observadas, sendo validadas, poderão ser utilizadas como marcadores moleculares para a identificação de pacientes com câncer de mama com alto risco de desenvolvimento de metástases nos linfonodos axilares.Abstract: Breast cancer is considered a major life-threatening disease in women. Currently, the prognosis is based on clinical and histopathological factors; the identification of tumor cells in axillary lymph nodes is the most effective prognostic factor. The sentinel lymph node (SLN) is the first node in the axilla to harbor malignant cells in breast tumors with metastasis, and its positivity is an indication for axillary lymph node dissection. Despite significant advances in the sentinel lymph node biopsy, there are still a significant number of false negatives results, especially in the case of micrometastasis. Therefore the accurate evaluation of the SLN, to identify even the smallest metastatic foci is essential prior to complete axillary lymph node dissection. In this study, we proposed to characterize the tumor cells present at the SLN using CGH (Comparative Genomic Hybridization) and array-CGH, global genomic approaches to identify DNA copy number changes. Paired cases of primary breast tumors (PBT) and SLN metastasis were analyzed using CGH (30 pairs) and array-CGH (10 pairs). Validation of array-CGH was performed by FISH (genes: BP1 and HER2) and Taqman Copy Number Assay (genes AKT1, AKT2, BP1, FGFR2, HER2, PIK3CA and PTEN). CGH analysis revealed gains of chromosomal regions involving, most frequently, 1p, 1q, 6p, 11p, 16, 17, 18q, 19, 20, 21 and 22. Chromosomal losses were mainly observed in 1p, 2q, 4q, 6q, 12q, 13q, 18q and Xq. Array-CGH analysis detected both amplifications and deletions, affecting mostly the chromosome regions 1q, 8q, 10q, 11q, 14q, 16p, 17q, 20q, 21q and Xq regions. Array-CGH end FISH results were concordant for the BP1 gene in 65% of cases and for HER2 in 55%. Concordance between array-CGH results and by Taqman Copy Number Assay was higher for genes BP1 (70,1%) and HER2 (64,7%), followed by genes AKT2 (41,2%), AKT1 and FGFR2 (29,4% each), PIK3CA (25,0%), and PTEN (11,8%). The assessment of copy number changes in the SLN metastasis using genomic profiling is a very sensitive method and can lead to the identification of genomic alterations that can reliably characterize breast tumor cells at the SLN lesions. Once these alterations are validated, they can be used as potential molecular markers to identify breast cancer patients at higher risk of developing axillary lymph node metastasis