Caracterização de proteínas da maquinaria de divisão do endosimbionte do protozoário tripanosomatídeo Crithidia deanei

Orientador : Stenio Perdigão FragosoDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 28/03/2008Inclui bibliografiaAlguns protozoários monoxênicos da família Trypanosomatidae, tais como Blastocrithidia culicis, Crithidia deanei Crithidia oncopelti, Crithidia desouzai e Herpetomonas roitmani apresentam bactérias simbióticas em seu citoplasma. A estreita relação desenvolvida entre a bactéria simbiótica e o tripanosomatídeo hospedeiro faz deste modelo uma excelente fonte para a melhor compreensão da origem simbiótica de organelas como a mitocôndria e o cloroplasto. É interessante destacar que no caso de tripanosomatídeos existe apenas uma bactéria simbiótica por célula, fato que implica a existência de um perfeito controle temporal da divisão celular destes microrganismos. Os fatores que realizam e controlam este processo, e a maneira como eles agem, são até agora desconhecidos. Caracterizamos, portanto, algumas proteínas-chave no processo de formação e de regulação do anel de divisão Z, o qual é importante para a formação do septo na região central da célula em divisão. Entre estas proteínas estão a FtsZ, a FtsK, a ZipA e o complexo proteíco MinCDE. Os genes que codificam essas proteínas foram identificados a partir do sequenciamento do genoma do endosimbionte de C. deanei, que está sendo realizado no Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP). Todos os genes estudados foram amplificados por PCR a partir do DNA do endosimbionte purificado de C. deanei. A análise das sequências de aminoácidos derivadas dos genes em questão mostra que elas compartilham maior similaridade com os ortólogos de bactérias do gênero Bordetella (subdivisão ß das proteobactérias). A expressão dos genes ftsZe, zipAe e minDe em E. coli induz a formação de filamentação, indicando que as proteínas recombinantes produzidas são funcionais e conseguem desestabilizar a maquinaria de divisão da E. coli. A expressão de todo o locus minCDE do endosimbionte não foi capaz de complementar cepa de E. coli PB114, que possui a deleção de todo o locus minCDE (DminCDE). A funcionalidade das proteínas FtsKe e MinDe foi também demonstrada pela sua capacidade de hidrolisar ATP. Quanto à proteína FtsZe, esta foi capaz de se polimerizar, característica importante para a formação do anel Z. Esses dados sugerem que proteínas do divisoma do endosimbionte se mantiveram funcionais durante a evolução dessa relação simbiótica. A análise, por microscopia de fluorescência, da expressão do gene da dinamina de Trypanosoma cruzi, fusionado ao gene GFP, em C. deanei, mostra que a proteína recombinante dinamina-GFP está associada com o endosimbionte. Esse resultado sugere o envolvimento da dinamina no processo de divisão do endosimbionte, como acontece na divisão de cloroplastos e mitocôndrias, e que este possa ser um dos mecanismos que o tripanosomatídeo hospedeiro utiliza para controlar a divisão do endosimbionte.Some monoxenous protozoa of the Trypanosomatidae family such as Blastocrithidia culicis, Crithidia deanei, Crithidia oncopelti, Crithidia desouzai and Herpetomonas roitmani harbor endosymbiotic bacteria in their cytoplasm. The relationship between the endosymbiont and the trypanosomatid provides an intersting model to understanding the emergence of eukaryotic organelles mitochondria and choroplasts. It is noteworthy to note that in the case of trypanosomatids there is only one symbiotic bacterium per cell, which implies the existence of a perfect control of the endosymbiont division. The factors that perform and control this process as well as their mechanisms remain unknown. In this regard, we characterized some key proteins involved in the processes of assembling and regulation of the Z ring, which are important steps in the division site formation in the mid-cell. Among these proteins, there are FtsZ, FtsK, ZipA and the complex MinCDE. The genes encoding these proteins were identified in the genome of the endosymbiont of C. deanei that has been sequenced in the Institute of Molecular Biology of Paraná (IBMP). All the studied genes were amplified by PCR from the genomic DNA of the endosymbiont purified from C. deanei. The analysis of the deduced amino acid sequences from these genes show that they share greater similarity with the orthologues from the Bordetella genus (subdivision of ß Proteobacteria). We showed that the expression of the genes ftsZe, zipAe and minDe in E. coli induce filamentation, indicating that these recombinant proteins were functional and could destabilize the division machinery in E. coli. The functionality of the proteins FtsKe and MinDe was also showed by their hability to hydrolise ATP. Regarding the FtsZe, we show that it was able to selfpolimerize, an important feature for the Z ring assembly. Taken together, these data suggest that proteins of the endosymbiont divisome have maintained their functionality during the evolution of the symbiotic relationship. Immunofluorescence microscopy analysis showed that the fusion protein GFPdynamin from T. cruzi expressed in C. deanei was associated with the endosymbiont. This result suggests the involvement of the dynamin in the endosymbiont division process as observed for the division of mitochondria and chloroplasts. Furthermore, dynamin may be one of the mechanisms used by the trypanosomatid to control the endosimbiont division