Análise metagenômica de composto lignocelulósico e caracterização fisiológica e molecular de uma nova estirpe de Bacillus sp.

Orientador : Profª. Drª. Leda Satie ChubatsuCoorientador : Prof. Dr. Fábio de Oliveira PedrosaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 12/12/2014Inclui referências: f. 34-39;56-63;92-95;112-118Resumo: A compostagem é um processo de decomposição da matéria orgânica caracterizado pela sucessão de comunidades microbianas complexas produtoras de várias enzimas que atuam sinérgica e especificamente ao longo do processo. Nesta tese, a análise metagenômica de um composto rico em material lignocelulósico revelou que gama Proteobacteria, representadas pelo gênero Cellvibrio foi o filo predominante na amostra seguido pelo filo Bacteroidetes representada pelo gênero Ohtaekwangia. A presença de organismos com capacidade de degradar compostos aromáticos, degradar celulose, interagir com plantas e fixar nitrogênio (Paludobacter, Azoarcus, Azospira) mostrou que a compostagem estudada é uma fonte promissora para a prospecção de enzimas envolvidas na degradação da biomassa vegetal. Utilizando uma cultura de enriquecimento de uma amostra do composto, foi isolada uma bactéria, denominada ABP14, que apresentou atividade celulolítica em meio CMC 0,5%. A análise da sequência parcial do gene 16S rRNA foi identificada como Bacillus sp. pertencente ao grupo Bacillus cereus sensu lato (s.l.). O isolado ABP14 apresentou atividade inseticida contra Anticarsia gemmtalis (lagarta do soja), mas sem a presença do cristal parasporal característico de Bacillus thuringiensis. O sequenciamento total do genoma do Bacillus sp. ABP14, utilizando as plataformas Illumina MiSeq e Ion Proton System, revelou a presença de dois replicons, um cromossomo de 5.141.367pb com conteúdo G+C de 35,4% e um plasmídeo circular (denominado pABP) com 11.199pb e 30,4% G+C. O cromossomo contém 5.238 genes codificantes de proteínas, 13 rRNA operons e 92 tRNA. A análise taxonômica baseada na hibridização DNA-DNA in silico, utilizando o programa GGDC 2.1, mostrou que Bacillus sp. ABP14 é geneticamente próximo de B. thuringiensis serovar finitimis YBT020 (Bt finitimus) com um GGDH de 81,3%, indicando pertencerem a mesma espécie. A análise genômica comparativa identificou genes específicos do Bacillus sp. ABP14 dentro do grupo B. cereus s.l. que codificam para enzimas da biossíntese da parede celular, proteínas de membrana e sistema de restrição. Difere exclusivamente do Bt finitimus pela presença de uma celulase, pelos genes envolvidos com competência celular, por um conjunto de genes que codificam proteínas que representam uma vantagem para a sobrevivência no ambiente intestinal do hospedeiro e pela ausência dos genes que codificam para as proteínas Cry. Bacillus sp. ABP14 e Bt finitimus compartilham mecanismos de proteção contra as defesas do hospedeiro, enzimas proteolíticas e adesinas, além de um conjunto de fatores de virulência comum em B. cereus stricto sensu. Dois genes identificados no genoma de Bacillus sp. ABP14, denominados chiABP-74 e chiABP-39, que codificam para quitinases foram clonados em pET29a (+), expressos em E. coli BL21(DE3), as proteínas parcialmente purificadas por cromatografia de troca iônica e caracterizadas bioquimicamente. O gene chiABP-74 codifica para uma proteína de 674 aminoácidos, incluindo um peptídeo sinal de 33 aminoácidos, com massa molecular de 74 kDa e pI de 5,67. O gene chiABP-39 codifica para uma proteína de 360 aminoácidos, incluindo um peptídeo sinal de 27 aminoácidos, com massa molecular de 39 kDa e pI de 6,21. A busca de similaridade realizada com a ferramenta Blast mostrou que as quitinase ChiABP-74 e ChiABP- 39 apresentam uma alta identidade (99%) com as quitinases de B. cereus e B. thuringiensis. A análise da sequência de aminoácidos revelou que as quitinases pertencem a família 18 das glicosil-hidrolases, a quitinase ChiABP-39 apresenta um único domínio catalítico (GH18) e a ChiABP-74 apresenta três domínios: o domínio catalítico GH18, um domínio fibronectina tipo- III (Fn3) e um módulo de ligação a carboidrato da família 2 (CBM2). As enzimas apresentaram atividade máxima em pH 5,0 a 50?C, a quitinase ChiABP-39 apresenta maior especificidade por quitina coloidal e sua atividade diminui na presença de SDS 0,5%, mas não sofre alteração na presença de íons divalentes. A quitinase ChiABP-74 é capaz de hidrolisar quitina coloidal e ?-quitina, e na presença de Mg+2 e Zn+2 na concentração de 10mM, bem como de SDS 0,5% apresenta redução da atividade enzimática. Palavras-chave: Compostagem, Bacillus, Genoma, Comparação Genômica, Quitinase.Abstract: Composting is an organic matter decomposition process characterized by a series of complex microbial communities that produce different enzymes acting in a synergistic and specific manner. In this work, a metagenomic analysis of a lignocellulosic rich compost revealed that Proteobacteria from the gamma class, represented by the Cellvibrio genus was the predominant phylum in the sample followed by the Bacteroidetes phylum, represented by the Ohtaekwangia genus. Among those, organisms able to degrade aromatic compounds, cellulose, plant-interact bacteria and nitrogen-fixers such as Paludobacter, Azoarcus and Azospira showed that this compost is a promising source for prospecting enzymes involved in the degradation of plant biomass. A culture enrichment in medium containing carboxymethyl-cellulose (CMC medium) of a compost sample allowed the isolation of a bacterium, named ABP14, which showed cellulolytic activity in CMC medium. Partial sequence of the 16S rRNA gene identified ABP14 as Bacillus sp. belonging to the B. cereus sensu lato (s.l.) group. Phenotypic analyses revealed that the isolated ABP14 showed insecticidal activity against Anticarsia gemmtalis (soybean caterpillar) but without the presence of parasporal crystal that is characteristic of Bacillus thuringiensis. The genome of Bacillus sp. ABP14 was sequenced using the Illumina MiSeq and Ion Proton System platforms revealed the presence of two replicons, a chromosome of 5,141,367 bp, with 35.4% of G + C content and a circular plasmid (denominated pABP) with 11,199 bp and 30.4% G + C. The chromosome contains 5,238 protein-encoding genes, 13 rRNA operons and 92 tRNA. Taxonomic analysis based on in silico DNA-DNA hybridization using the GGDC 2.1 server program showed that Bacillus sp. ABP14 is genetically close to B. thuringiensis serovar finitimis YBT020 (Bt finitimus) with a GGDH of 81.3%, indicating that they belong to the same species. The comparative genomic analysis identified specific genes of Bacillus sp. ABP14 within the B. cereus s.l. group encoding cell wall biosynthesis enzymes, membrane proteins and restriction system. ABP14 differs exclusively from Bt finitimus by the presence of genes coding for cellulase, genes involved with cell competence, and a number of genes encoding proteins that represent an advantage for survival in the gut environment of the host and the absence of the genes encoding for the Cry proteins. Bacillus sp. ABP14 and Bt finitimus share mechanisms of protection against host defenses, proteolytic enzymes and adhesin, in addition to a set of virulence factors that are common in B. cereus stricto sensu. Two genes identified in the genome of Bacillus sp. ABP14, called chiABP-74 and chiABP-39, encoding chitinase were cloned into pET29a (+), expressed in E. coli BL21(DE3), partially purified by ion exchange chromatography and biochemically characterized. The gene chiABP 74 encodes a protein of 674 amino acids including a signal peptide of 33 amino acids with a molecular mass of 74 kDa and pI of 5.67. Gene chiABP-39 encodes a protein of 360 amino acids including a signal peptide of 27 amino acids with a molecular mass of 39 kDa and pI of 6.21. The similarity search performed with the Blast tool showed that the chitinase ChiABP-74 and ChiABP-39 have a high identity (99%) with chitinase B. cereus and B. thuringiensis. The analysis of the amino acid sequence revealed that the chitinases belong to family 18 of the glycosyl hydrolases, chitinase ChiABP-39 has a single catalytic domain (GH18) and ChiABP- 74 has three domains: the catalytic domain GH18, a fibronectin-type III (Fn3) domain and a carbohydrate-binding module of family 2 (CBM2). The enzymes showed maximum activity in pH 5.0 at 50?C, chitinase ChiABP-39 has specificity for colloidal chitin and its activity decreases in the presence of 0.5% SDS, but it does not change in the presence of divalent ions. Chitinase ChiABP-74 is able to hydrolyse ?-colloidal chitin and chitin in the presence of 10mM Mg+2 and Zn+2, as well as of 0.5% SDS, it shows reduced enzymatic activity. Keywords: Composting, Bacillus, Genome, Genomic comparison, Chitinase