Development of a biotreatment for delignification of sugarcane bagasse and production of laccases

Resumo: A valorização de agro-resíduos por rotas biológicas é uma tecnologia chave que contribui para o desenvolvimento de processos sustentáveis e para a geração de produtos de alto valor agregado. O bagaço de cana é um agro-resíduo lignocelulósico produzido em grandes quantidades pela indústria sucroalcooleira no Brasil. A utilização do bagaço de cana como matéria-prima tem sido limitada pela presença de lignina e hemiceluloses, que restringem a hidrólise eficiente da celulose. A deslignificação é um pré-tratamento necessário no processo de conversão da biomassa vegetal em açúcares fermentescíveis. A degradação biológica da lignina pode ser realizada pelos fungos da podridão branca, que produzem enzimas oxidativas, especialmente lacases, manganês peroxidases e lignina peroxidases. As lacases recebem muita atenção pois oxidam tanto compostos fenólicos como não fenólicos e usam oxigênio como aceptor final de elétrons. Elas apresentam muitas aplicações industriais relacionadas à oxidação de substâncias fenólicas. Os objetivos desta pesquisa foram: selecionar uma cepa de basidiomiceto capaz de degradar lignina e produzir lacase no bagaço de cana, e realizar sua identificação molecular por sequenciamento de DNA; otimizar a produção de lacase e determinar seu modelo matemático, pelo processo de fermentação sólida do bagaço de cana; avaliar o efeito de indutores e diferentes concentrações de nitrogênio no padrão de isoformas de lacases produzidas em fermentação sólida do bagaço de cana pela cepa selecionada; avaliar a cinética de deslignificação biológica do bagaço de cana pela cepa selecionada em fermentação sólida, sob condições otimizadas para a produção de lacase; recuperar e concentrar a lacase e realizar a deslignificação enzimática do bagaço de cana. Dentre 45 cepas de basidiomicetos, uma cepa de Pleurotus sp. apresentou atividade de lacase significativamente superior às demais cepas (183 U/L após 5 dias de crescimento em condição semi-sólida). A região ITS do rDNA fúngico foi amplificada por PCR e a cepa foi identificada como Pleurotus ostreatus pela análise da sequência ITS1-5.8rDNA-ITS2. A produção de lacase pela cepa selecionada de P. ostreatus foi avaliada em fermentação sólida do bagaço de cana e o pico de atividade enzimática foi atingido ao 5º dia de fermentação (2.05 U/g). Dentre oito variáveis, as concentrações de CuSO4 e (NH4)2SO4 demonstraram influenciar significativamente a produção de lacase. A substituição do sulfato de amônio por extrato de levedura e a adição de ácido ferúlico como indutor conferiram aumentos de 5,7 e 2,0 vezes, respectivamente, na produção de lacase. A otimização da produção de lacase como função das concentrações de extrato de levedura, sulfato de cobre e ácido ferúlico foi realizada pela metodologia da superfície de resposta e as concentrações ótimas foram 6,4 g/L, 172,6 ?M e 1,86 mM, respectivamente, e a atividade máxima de lacase prevista pelo modelo (R² 0,8753) foi de 161,3 U/g. Experimentalmente, a máxima atividade de lacase de 151,6 U/g foi produzida ao 5º dia de fermentação no estado sólido. Zimogramas indicaram a presença de seis isoformas de lacases (POXA1b, POXA3, POXC e três outras isoformas). Os resultados de identificação protéica por espectrometria de massa confirmaram a presença de POXC e POXA3 como as principais isoenzimas, e também identificaram uma glioxal oxidase e três galactose oxidases. O fato de a enzima POXA1b não ter sido identificada nas amostras analisadas pode ser possivelmente explicado por sua sensibilidade à degradação por proteases. O teor de lignina foi reduzido de 31,89% para 26,36% após 5 dias e para 20,79% após 15 dias pelo tratamento biológico de fermentação sólida. A hidrólise enzimática reduziu o teor de lignina de 31,89% para 14,98% em 12h