Clatrina em Trypanosoma Cruzi : identificação do gene e localização celular

Orientador : Prof.Dr. Maurílio José SoaresDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 18/02/2011Bibliografia: fls. 72-78Resumo: Entender a via endocítica de protozoários parasitas da família Trypanosomatidae (Euglenozoa: Kinetoplastea) é fundamental, pois esta via desempenha um importante papel no direcionamento intracelular de nutrientes e de agentes terapêuticos. Esta dissertação teve por objetivo avaliar a participação da clatrina nos eventos iniciais de endocitose em Trypanosoma cruzi, bem como sua localização ub-celular. Assim, identificamos no genoma de T. cruzi os genes que codificam a cadeia pesada de clatrina (Tc00.1047053506167.50 - TcClatrina), a cadeia leve de clatrina (Tc00.1047053506211.240 - TcCLC), para a subunidade do complexo adaptador AP (Tc00.1047053506247.200 - APb). Foram produzidos anticorpos policlonais em camundongo para cada uma dessas quatro proteínas. Análise por Western blot demonstrou que os antisoros para TcClatrina e APb reagiram com polipeptídios de peso molecular previsto em diferentes tripanosomatideos. Usando o anticorpo para TcClatrina observamos por microscopia confocal a localização desta proteína na bolsa flagelar de formas epimastigotas e na região compatível com o Complexo de Golgi e formas tripomastigotas de T. cruzi. Além disso, também houve reação positiva ifusa pelo citoplasma das células, o que corresponderia às moléculas de clatrina não polimerizadas. Os dados indicam que na bolsa flagelar de T. cruzi ocorre endocitose mediada por clatrina. Marcação da TcClatrina foi positiva também na região da bolsa flagelar de Crithidia deanei, C. fasciculata e Phytomonas serpens, demonstrando assim que esta proteína é bem conservada nos tripanosomatídeos e que a ndocitose de nutrientes nestes parasitas parece ocorrer na bolsa flagelar mediada por clatrina. Também obtivemos reação positiva para a cadeia leve de clatrina por microscopia confocal em diferentes tripanosomatídeos (C. deanei, C. fasciculata, Blastocrithidia culicis e P. serpens), possivelmente associada ao Complexo de Golgi. Por microscopia eletrônica de transmissão (MET) localizamos esta proteína associada à membrana da bolsa flagelar de epimastigotas de T. cruzi, indicando uma associação com a cadeia pesada da clatrina, como esperado. Nossos dados por Western blot demonstraram a expressão de clatrina (cadeia leve e pesada) e da subunidade do complexo adaptador AP em T. cruzi e em outros tripanosomatídeos. Dados de imunoprecipitação mostraram que a cadeia leve de clatrina e a subunidade APb do complexo adaptador AP interagem com a cadeia pesada de clatrina, como esperado.Abstract: Understanding the endocytic pathway of protozoan parasites of the family Trypanosomatidae (Euglenozoa: Kinetoplastea) is fundamental, because this pathway plays an important role in intracellular targeting of nutrients and therapeutic agents. Aim of this dissertation was to evaluate the involvement of clathrin in the initial events of endocytosis in Trypanosoma cruzi, as well as its sub-cellular location. Thus, we have identified in the genome of T. cruzi genes encoding the clathrin heavy chain (Tc00.1047053506167.50 - TcClatrina), hypothetical clathrin light chain (Tc00.1047053506211.240 - TcCLC) and an subunit of he adapter complex AP (Tc00.1047053506247.200 - AP). Polyclonal antibodies were produced in mice against each of these four proteins. Western blot analysis showed that the antisera for TcClatrina and AP reacted with polypeptides of expected molecular weight in different trypanosomatids. Using the antibody against TcClatrina we have observed by confocal microscopy the localization of this protein in the flagellar pocket of epimastigotes and in the region compatible with the Golgi complex of trypomastigotes of T. cruzi. Moreover, there was also diffuse positive reaction throughout the cell cytoplasm, which corresponds to olecules of non-polymerized clathrin. Our data indicate that clathrin-mediated endocytosis occurs at the flagellar pocket of T. cruzi. Tagging TcClatrina was also positive in the flagellar pocket region of Crithidia deanei, C. fasciculata and Phytomonas serpens, which demonstrate that this protein is well conserved in trypanosomatids and that clathrin-mediated endocytosis of nutrients in these parasites occurs at the flagellar ocket membrane. We also obtained positive reaction for the clathrin light chain by confocal microscopy in different trypanosomatids (Blastocrithidia culicis, C. deanei, C. fasciculata and P. serpens), possibly associated with the Golgi Complex. By transmission electron microscopy (TEM) we could localize t is protein associated with the flagellar pocket membrane of T. cruzi epimastigotes, indicating an association with the clathrin heavy chain, as expected. Our Western blot data demonstrated the expression of clathrin (heavy and light chain) and an subunit of the AP adapter complex in T. cruzi and other trypanosomatids. Immunoprecipitation data showed that the clathrin light chain and the APb subunit of the adapter complex AP interact with the clathrin heavy chain, as expected