Caracterización genética y funcional de la bacteria probiótica Pediococcus parvulus 2.6

208 p.-49 fig.-13 tab.[EN]Linear and branched β-glucans, particularly those linked by β-(1, 3) bounds synthesised by plants and fungi, can act as immunomodulators and therefore can be beneficial to human health. These homopolysaccharides (HoPS) have been extensively used in traditional medicine, and now are considered to be potentially useful for the development of functional foods. Also, β-glucans have started to be used in the livestock and aquaculture industries as substitutes for antibiotics to prevent infection. A 2-substituted (1,3)-β-glucan produced primarily by lactic acid bacteria (LAB) has been described, in particular by Pediococcus parvulus 2.6, which is the architype of bacteria producing this β-glucan. For this reason, the physico-chemical characteristics of this HoPS from the 2.6 strain, its production and influence on metabolism have been previously investigated. Moreover, certain probiotic properties of the 2.6 strain such as resistance to gastrointestinal stress or adhesion to epithelial cells, as well as the modulating effect of its β-glucan on human macrophages, have been characterized in vitro. In this thesis, an immunological method for the specific detection and quantification of the 2-substituted (1, 3)-β-glucan is described (Chapter 1). This technique is based on the recognition of the bacterial β-glucan by a specific antibody against Streptococcus pneumoniae serotype 37. This pneumococcal strain produces a capsule composed of a similar β-glucan to the LAB producers. This method has been used for the characterization of the enzymatic activity of the GFT glycosyltransferase responsible for the β-glucan production in P. parvulus 2.6 (Chapter 1). The study was performed in membrane vesicles containing the GTF protein, and the catalytic constants were determined. In addition, this method was validated for quantification of this HoPS in different states: (i) pure (Chapter 1), (ii) included in bacterial cultures supernatants (Chapters 1, 4, 5 and 7), (iii) attached to the producing bacteria (Chapter 5) and (iv) included in food matrices (Chapter 6). The draft genome of P. parvulus 2.6 has been described (Chapter 2), this being the first genome sequenced for this species. Its size was estimated as 2.236 kbp, containing 2.241 genes. Its analysis revealed the absence of genetic determinants for unwanted activities such as antibiotic resistance or biogenic amine production. It also showed the presence of the gutFRMCBA (gut) operon involved in sorbitol utilisation. This operon is composed of six genes: gutF encodes a sorbitol-6-P dehydrogenase; gutR and gutM encode two putative regulators; and gutC, gutB and gutA encode the EII domain of a phosphoenolpyruvate:sorbitol phosphotransferase transport system.Therefore, the utilization of sorbitol as a carbon source by P. parvulus was investigated (Chapter 4). The conditions for the best sorbitol metabolism were standardised (Chapter 7). A co-metabolism with glucose and sorbitol showed that the 2.6 strain first metabolises the glucose and then the sorbitol, indicating that the expression of the gut operon is subject to catabolite repression upon growth in the presence of glucose. Analysis of the metabolic fluxes and the β-glucan production in P. parvulus 2.6 has demonstrated that sorbitol can act as a precursor for the production of the β-glucan (Chapter 4). Furthermore, a promoter-probe vector was developed to perform transcriptional analyses in LAB, based on the expression of the mrfp gene which encodes the red fluorescent protein mCherry (Chapter 3). This vector was used to investigate the transcriptional regulation of the expression of the pediococal sorbitol utilisation gut operon (Chapters 4 and 7). For this study, the putative promoter sequence (Pgut) and two genes encoding two putative regulatory proteins (GutR and GutM) were cloned independently, or together, in transcriptional fusions with the mrfp gene. The study was carried out in two heterologous hosts, Lacobacillus plantarum and Lactobacillus casei, which also utilise sorbitol. The results demonstrated trans-complementation for activation of Pgut in L. plantarum but not in L. casei, upon growth in the presence of sorbitol. The results indicated that GutR is a transcriptional activator and GutM is needed for the correct functionality of Pgut. In addition, a model for regulation of expression of the gutFRMCBA in P. parvulus 2.6 has been postulated. Responses of P. parvulus 2.6 and its isogenic β-glucan non-producing 2.6NR strains to various in vitro technological stresses have been evaluated (Chapter 7). The results showed a protective effect of the β-glucan to alcoholic stress and, also that ethanol could be an inducer of the EPS production.P. parvulus strains were fluorescently labelled by transferring the pRCR12 plasmid which carries the strong pneumococcal Px promoter fused to the mrfp gene (Chapter 5). As far as we know this is the first fluorescent labelling of P. parvulus. In addition, the constitutive production of mCherry from pRCR12 did not affect growth of the pediococcal strains nor the β-glucan production by 2.6. Also, bacterial adhesion of 2.6[pRCR12] (2.6p) and 2.6NR[pRCR12] (2.6NRp) to enterocytes was assessed in an in vitro Caco-2 cells model. The results revealed that the presence of the β-glucan attached to the 2.6p surface enhances the bacterial binding capacity as previously detected for the 2.6 strain. Also, the adhesion of 2.6NRp was improved by supplementation with the purified β-glucan, demonstrating the positive effect of the β-glucan in the bacterium- enterocyte interaction. The probiotic properties of P. parvulus, as well as the immunomodulatory capacity of its β-glucan, have been investigated by using in vivo zebrafish models (Chapter 5). A gnotobiotic larval model was used to study the colonising ability of fluorescent-labelled P. parvulus strains. The red fluorescent signal emitted by the bacteria was detected inside the gastrointestinal tract (GIT) of the larvae, thereby monitoring the bacterial colonisation in real time. Analysis of viable bacteria inside the larvae revealed that the 2.6p strain colonises the zebrafish GIT better than 2.6NRp, indicating a positive effect of the β-glucan in colonisation. Furthermore, the gnotobiotic larvae, pre-treated with the bacterial solutions, were infected with the pathogen Vibrio anguillarum. Both strains were able to counteract the infection, reducing the zebrafish mortality, but strain 2.6p in a more efficient manner, supporting the probiotic potential of the strain. In addition, a gnotobiotic zebrafish model was used to study the modulation of the innate immune system of zebrafish by the P.parvulus 2.6 β-glucan (Chapter 5). The treatment with the purified β-glucan provoked a reduction in the gene expression of IL8, TNFα and MyD88 in zebrafish immune cells, suggesting an anti-inflammatory response. Subsequently, the zebrafish Tg(mpx: GFP) line was used to perform an induced inflammation model, by cutting the tail´s apical region off. This transgenic line expresses the GFP protein constitutively in the neutrophils, so their recruitment to the inflammation zone and their proliferation can be detected and quantified by fluorescent measurements. The exposure to the bacterial β-glucan provoked, in the treated larvae, a significant reduction of neutrophilic recruitment and proliferation. These results showed the potential of the pediococcal β-glucan as an anti-inflammatory agent. Finally, the ability of P. parvulus strains to ferment oat, barley and rice matrices was investigated (Chapter 6). P. parvulus was not able to ferment the barley matrix, and fermented the oat matrix better than the rice one. Fermentations with both 2.6 and 2.6NR strains showed that the β-glucan production by the former results in an increase of viscosity of the matrices. In addition, the prebiotic potential of the fermented cereal-based foods fortified with the β-glucan produced in situ by P. parvulus 2.6 has been validated with L. plantarum WCFS1 strain. The growth and survival under GIT condition of the WCFS1 strain was superior when the bacterium was included in the bacterial β-glucan enriched foods.[ES]Los β-glucanos lineales y ramificados, especialmente aquellos unidos mediante enlaces β-(1,3) y sintetizados por plantas y hongos, pueden actuar como inmunomoduladores ejerciendo efectos beneficiosos sobre la salud humana. Estos homopolisacáridos (HoPS) se han utilizado extensamente en la medicina tradicional de ciertas culturas, y en nuestros días son considerados como compuestos bioactivos para el desarrollo de nuevos alimentos funcionales. Así también, los β-glucanos se utilizan como sustitutivos a los tratamientos antibióticos en industrias como la acuicultura y la ganadería. Se ha descrito un (1,3)-β-glucano ramificado en posición O-2 producido principalmente por las bacterias del ácido láctico (BAL), entre las cuales Pediococcus parvulus 2.6 es el prototipo de bacteria productora de este β-glucano. En este HoPS, se han investigado sus características físico-químicas, su producción y su influencia en el metabolismo bacteriano. Además, alguna de las propiedades probióticas de la bacteria como su resistencia al estrés gastrointestinal o su adhesión a células epiteliales han sido caracterizadas in vitro, así como la capacidad de su β-glucano de modular macrófagos humanos. En esta tesis, se ha descrito un método inmunológico capaz de detectar y cuantificar específicamente el β-glucano bacteriano (Capítulo 1). Esta técnica se basa en el reconocimiento de este β-glucano por un anticuerpo específico para Streptococcus pneumoniae serotipo 37. Este neumococo produce una capsula que se compone por un β-glucano muy similar al producido por BAL. El método se ha utilizado para la caracterización de la actividad enzimática de la glicosiltransferasa GTF, responsable de la producción del β-glucano en P. parvulus 2.6, mediante el uso de vesículas membranosas que contenían el enzima determinando las constantes catalíticas (Capítulo 1). Por otra parte, este método fue validado para la cuantificación del HoPS en diferentes estados: (i) puro (Capítulo 1), (ii) contenido en sobrenadantes de cultivos bacterianos (Capítulos 1, 4, 5 y 7), (iii) unido a las bacterias productoras (Capítulo 5) y (iv) contenido en matrices alimentarias (Capítulo 6). Se ha descrito el borrador del genoma del P. parvulus 2.6 (Capítulo 2), siendo este el primer genoma secuenciado de esta especie. Su tamaño se ha estimado en 2.236 kpb y se han detectado 2.241 genes. El análisis del genoma reveló la ausencia de determinantes genéticos involucrados en actividades indeseadas como puede ser la resistencia a antibióticos o la producción de aminas biógenas. También, se ha descrito la presencia de la agrupación genética gutFRMCBA (operón gut), cuyos genes están implicados en la utilización del sorbitol por la bacteria. El operón se compone de 6 genes: el gen gutF que codifica una sorbitol-6-P deshidrogenasa; los genes gutR y gutM que codifican dos posibles reguladores; y los genes gutC, gutB y gutA que codifican el dominio EII de un sistema de transporte fosfotransferasa dependiente de fosfoenolpiruvato específico para el sorbitol.Por lo tanto, la utilización del sorbitol como fuente de carbono para el metabolismo de P. parvulus fue investigada (Capítulo 4). Primero, se estandarizaron las condiciones óptimas para su metabolismo (Capítulo 7). El cometabolismo de la glucosa y el sorbitol mostró que la cepa 2.6 metaboliza primero la glucosa y después el sorbitol, indicando que la expresión del operón gut se encuentra sujeta a represión por catabolito en el crecimiento en presencia de glucosa. El análisis de los flujos metabólicos y la producción del sorbitol en P. parvulus 2.6 han demostrado que el sorbitol puede actuar como precursor para la producción del β-glucano (Capítulo 4). Por otra parte, se ha desarrollado un vector para evaluar promotores que permite realizar análisis transcripcionales en BAL, basado en la expresión del gen mrfp que codifica la proteína fluorescente roja mCherry (Capítulo 3). Nos hemos valido de este vector para investigar la regulación transcripcional de la expresión del operón gut pediocócico de utilización del sorbitol (Capítulos 4 y 7). Para la realización de este estudio, la posible secuencia promotora (Pgut) así como los dos genes que codifican dos posibles proteínas reguladoras (GutR y GutM), fueron clonados, de forma independiente o en conjunto, produciendo fusiones transcripcionales con el gen mrfp. El estudio se llevó a cabo en dos huéspedes heterólogos, Lactobacillus plantarum y Lactobacillus casei, que también utilizan el sorbitol. Los resultados mostraron que en el crecimiento en presencia de sorbitol se produjo una trans-complementación en la activación de Pgut en L. plantarum, pero no así en L. casei. Los resultados también indicaron que GutR es un activador transcripcional y que GutM es necesaria para el correcto funcionamiento de Pgut. Además, se ha postulado un modelo para la regulación de la expresión de gutFRMCBA en P. parvulus 2.6. Se ha evaluado in vitro la respuesta de P. parvulus 2.6 y de su cepa isogénica 2.6NR a varios estreses tecnológicos (Capítulo 7). Los resultados mostraron un efecto protector del β-glucano frente a un estrés alcohólico, y además, el etanol puede ser un posible inductor de la producción de EPS. Las cepas de P. parvulus 2.6 fueron marcadas fluorescentemente mediante la transferencia del plásmido pRCR12, el cual porta el promotor neumocócico fuerte Px fusionado al gen mrfp (Capítulo 5). Hasta donde nosotros sabemos, esta es la primera vez que se marca fluorescentemente P. parvulus. Además, la producción constitutiva de la proteína mCherry a partir de pRCR12 no afectó ni al crecimiento de las cepas ni a la producción del β-glucano por la cepa 2.6. También, se evaluó la capacidad de adhesión a enterocitos de 2.6[pCRC12] (2.6p) y 2.6NR[pRCR12] (2.6NRp) utilizando un modelo in vitro de células Caco-2. Los resultados revelaron que la presencia del β-glucano unido a la superficie de 2.6p aumenta la capacidad de unión de la bacteria, como ya se detectó previamente en la cepa 2.6. Además, la adhesión de 2.6NRp fue mejorada mediante la suplementación con el β-glucano purificado, demostrando así el efecto positivo del β-glucano en la interacción bacteria-enterocito.Las propiedades probióticas de P. parvulus, así como la capacidad inmunomoduladora de su β-glucano han sido investigadas usando modelos in vivo de pez cebra (Capítulo 5). Para el estudio de la colonización de las cepas marcadas fluorescentemente de P. parvulus se utilizó un modelo larvario gnotobiótico. La señal fluorescente roja emitida por las bacterias en el interior del tracto gastrointestinal (TGI) de las larvas fue detectada, lo que permitió monitorizar en tiempo real la colonización bacteriana. El análisis de las bacterias viables en el interior de las larvas reveló que la colonización del TGI del pez cebra por la cepa 2.6p fue mejor que por la cepa 2.6NRp, indicando un efecto positivo del β-glucano en la colonización. Además, las larvas gnotobióticas, pretratadas con las soluciones bacterianas, fueron infectadas con el patógeno Vibrio anguillarum. Ambas cepas fueron capaces de contrarrestar los efectos de la infección, reduciendo la mortalidad de los peces cebra, sin embargo la cepa 2.6p lo hizo de una manera más eficaz, poniendo en valor su potencial probiótico. Por otra parte, el modelo gnotobiótico del pez cebra fue utilizado para estudiar la modulación del sistema inmune innato del pez cebra por parte del β-glucano de P. parvulus 2.6 (Capítulo 5). El tratamiento con el β-glucano purificado provocó una reducción en la expresión genética de la IL8, TNFα y MyD88 en las células inmunes del pez cebra, lo que sugiere una respuesta antiinflamatoria. Posteriormente, la línea transgénica de pez cebra Tg(mpx: GFP) fue utilizada para desarrollar un modelo de inflamación inducida, mediante el seccionamiento de la región apical de la cola. Las larvas de esta línea transgénica expresan la proteína GFP de forma constitutiva en los neutrófilos, así se puede detectar su reclutamiento a la zona de inflamación y su proliferación mediante medidas de fluorescencia. La exposición de las larvas al β-glucano bacteriano provocó una reducción significativa del reclutamiento y proliferación de los neutrófilos. Estos resultados mostraron el potencial del β-glucano pediocócico como un agente antiinflamatorio. Finalmente, se investigó la capacidad de las cepas de P. parvulus para fermentar matrices alimentarias basadas en avena, cebada y arroz (Capítulo 6). P. parvulus no fue capaz de fermentar la matriz de cebada, sin embargo fermentó las matrices de arroz y avena, esta última más eficazmente. Las fermentaciones tanto con 2.6 como con 2.6NR permitieron observar como la producción del β-glucano por la primera cepa resultó en un incremento de la viscosidad de las matrices. Además, el potencial prebiótico de estos alimentos generados, fortificados con la producción in situ del β-glucano bacteriano, ha sido validado con la cepa L. plantarum WCFS1. Tanto el crecimiento de WCFS1 como su supervivencia a condiciones de estrés del TGI fueron superiores cuando la bacteria fue incluida en los alimentos biofortificados con el β-glucano.Contratos predoctorales para la formación de doctores BES-2013-065157 del Ministerio de Economía y Competividad. Proyecto del Plan Nacional AGL2015-65010-C3-1-R del CSIC; proyectos AGL2012-40084-C03-01 y AGL2015-65010-C3-1-R. del MINECOPeer reviewe