Épissage alternatif de l'ARN pre-messager du gène N-CAM de souris

L'expression du gène N-CAM (neural-cell adhesion molecule) de souris est étroitement contrôlée par l'épissage alternatif du transcrit primaire. Plus particulièrement, l'inclusion de l'exon alternatif 18 (801 nt) se produit uniquement dans des cellules d'origine neuronale. Pour évaluer le rôle des séquences de l'exon 18 (E1 8) et des exons flanquants E17 et E19 et tenter d'identifier des facteurs impliqués dans la régulation de l'épissage alternatif de E18, nous avons, dans un premier temps, caractérisé les profils d'épissage de E18 dans diverses lignées cellulaires. Dans les lignées de fibroblastes N1H3T3 et 3T6, moins de 5% des ARNm de N-CAM produits contiennent E18. Par contre, cet exon est présent dans plus de 40% des ARNm de N-CAM exprimés dans la lignée neuronale N2a. Lorsque les cellules N2a sont induites à se différencier, ce pourcentage augmente à environ 75%. Les cellules N2a ont été transfectées avec un mini-gène contenant les exons 17, 18 et 19. L'analyse des ARNm de N-CAM issus du mini-gène montre que les régions importantes pour la régulation de l'épissage de E18 sont inclues dans le mini-gène. A partir de segments de ce mini-gène, une étude plus détaillée des signaux d'épissage de E18 a été réalisée in vitro des substrats offrant différentes combinaisons entre des paires d'exons N-CAM et les exons L1 et L2 d'adénovirus. Un substrat El 7-E 18-E 19 533 permettant une compétition entre les signaux d'épissage 3' E18 et E19 a également été analysé in vitro dans les extraits Hela, N2a et N1H3T3. Il a été observé que, pour les extraits Hela et N2a, le site 3' proximal E18 est choisi à 80% et pour l'extrait NIH3T3, le site 3" distal E19 est choisi à 70%. Le choix différenciel entre les signaux d'épissage 3' E18 et 3' E19 in vitro suggère que ces régions participent à la régulation de l'épissage alternatif de E18. Cet épissage différentiel n'est pas observable lorsque des substrats simples E17-E 18, E17-E19 et E18-E19 sont utilisés. Nous observons plutôt une faible efficacité d'épissage de ces substrats, ce qui suggère une incompatibilité entre les exons N-CAM malgré la force théorique des signaux d'épissage 5' et 3'. Lorsque les exons N-CAM sont combinés aux exons d'adénovirus, l'épissage est très efficace. Les résultats obtenus indiquent que l'incompatibilité entre les paires d'exons N-CAM semble s'effectuer à différents niveaux pour chacun des substrats. Ainsi, on observe une forte interaction du snRNP U2 avec le substrat E17-E19 par la formation du complexe pré-spliceosomal et une bonne liaison du facteur d'épissage U2AF. Par contre, le snRNP U2 interagit faiblement avec l'ARN E17-E18 même si U2AF se lie très bien. Pour le substrat E18-E19, l'interaction du snRNP U2 se fait très bien malgré une interaction différente par le facteur U2AF. Les mécanismes exacts responsables de ces incompatibilités entre paires d'exons N-CAM sont inconnus mais pourraient être important dans la régulation de l'épissage de l'exon E18