Modulation of calcium currents by pharmacological agents, naturally occuring toxins and phosphorylation in normal and abnormal cardiac and skeletal muscle

Résumé: Le but de ce travail est de comprendre la modulation des canaux calciques cardiaques par les antagonistes calciques, organique et inorganique ainsi que par certaines toxines et la phosphorylation. De plus, on a vérifié si les canaux calciques subissent des changements dans la cardiomypathie héréditaire du hamster et la dystrophyie musculaire de Duchenne (DMD). Dans cette étude, on a utilisé cinq différentes préparations cardiaques: cellules isolées du coeur 1) embryonnaire de poulet de trois jours, 2) embryonnaire de poulet de 10 jours, 3) foetal humain, 4) du hamster nouveau-né normal et 5) du hamster nouveau-né cardiomyopathique. De plus, on a aussi utilisé deux préparations des myotubes de muscle squelettique humain normal et dystrophique (DMD). Toutes les préparations cardiaques ont généralement exprimé deux types de canaux calciques: un courant calcique de type T Ica,T qui s'active et s'inactive rapidement et un courant ICa de type L Ica,L qui s'active et s'inactive lentement par rapport au type T. Le type T de ICa a un potentiel de demi-inactivation (Vo.5) situé 20 à 30 mV plus négativement que le type L. Pour cette raison, il est possible de séparer le type L du type T en maintenant le potentiel du clamp à -50 mV. A ce niveau de potentiel le ICa de type T est presque non mesurable (ou non disponible), par contre le type L est parfaitement disponible pour être activé par une dépolarisation de la membrane. De plus, le potentiel du pic de la courbe courant-voltage est plus négatif que celui du type L: entre -20 et -10 mV pour le type T et entre +10 et +20 mV pour le type L. Le type T et le type L des myocytes ventriculaires de l'embryon de poulet âgé de 10 jours et de fœtus humain sont sensibles aux bloqueurs inorganiques du canal calcique, le Mn2+ par contre, le Cd2+ bloque le type L et le Ni2+ semble être un bloqueur sélectif de ICa de type T. Les bloqueurs organiques des canaux calciques de la famille des dihydropiridines (DPH) comme la nifédipine et le PN 200-110 bloquent le ICa de type L de 50% à une concentration entre 5 et 10 µM et ce degré de bloquage dépend de la concentration extracellulaire en calcium. Le nouvel agent antiasmatique, l'azelastine, bloque le ICa,L a des concentrations de l'ordre du nanomolaire. Par contre avec cette concentration d'azelastine, cette drogue produit une importante augmentation du courant calcique de type T. L'apamine, une toxine du venin d'abeille bloque sélectivement et complément le ICa,L a une concentration de 10'°M. A notre connaissance, l'apamine est la première toxine naturelle qui semble être un bloqueur puissant et sélectif de courant Ca2+ de type L du muscle cardiaque. L'anesthésique local, bupivacaine, semble être un puissant bloqueur mais non sélectif du courant calcique de type L. Ces observations peuvent expliquer en partie la cardiotoxicité de cette rogue. Les activateurs de la protéine kinase dépendent de l'AMPc (PKA) stimule le ICa,L . Ces activateurs (AMPc, isoproterenol et forskoline) n'ont pas d'effet sur le ICa,L enregistré à 22°C. La dépendence de la température de la phosphorylation de ICa,L par le PKA peut expliquer en partie la valeur élevée du Q10 de ICa,L des cellules cardiaques. L'angiotensine II a des concentrations nanomolaires stimule d'une façon réversible le ICa,T . Une légère diminution de ICa,L par l'Ang II a été observée. Le mécanisme par lequel l'Ang II exerce son effet sur les courants Ca2+ peut être dû en partie à la stimulation de certains types de protein Kinase C. Il est à noter que des travaux supplémentaires sont nécessaires afin d'expliquer le mécanisme d'action de l'Ang II sur les courants calciques cardiaques. Dans la cardiomyopathie héréditaire du hamster, on a observé que le pourcentage de cellules qui montrent un courant de type T augmente. De plus, le courant de fenêtre de ICa,T des cellules cardiaques du hamster cardiomyopathique est 10 fois plus large que le courant de fenêtre de ICa,T des cellules cardiaques du hamster normal. Ces observations peuvent expliquer en partie l'augmentation de flux entrant calcique dans les cellules cardiaques du hamster cardiomyopathique. Il est intéressant de noter que le courant lent de type L subit des changements dans les myotubes de muscle squelettique dystrophique de Duchenne. La courbe de relation courant-voltage (I/V) ainsi que la courbe d'inactivation de IBa, dans les myotubes de DMD sont déplacés vers des potentiels plus positifs que ceux des myotubes normaux. En conclusion, cette étude nous a permis de confirmer que les propriétés électriques et pharmacologiques des canaux calciques de type T et de type L dans les cellules cardiaques de l'embryon de poulet âgé de 10 jours sont similaires à celles du hamster nouveau-né et à celles du fœtus humain. Ces propriétés électriques et pharmacologiques du canal T et du canal L cardiaques sont aussi similaires aux canaux calciques rapportés dans d'autres espèces animales. De plus, plusieurs nouvelles informations concernant la pharmacologie et la phathologie des canaux calciques ont été décrites dans ce travail. || Abstract: This study was aimed at understanding modulation of cardiac Ca2+ channels by inorganic and organic antagonists, phosphorylation and naturally occuring toxins. We also investigated possible abnormalities of Ca2+ currents in a model of congenital cardiomyopathy (Sirian hamster) and human Duchenne skeletal muscle distrophy. Three different cardiac preparations were used: 10-day-old chick embryo heart cells, fetal human ventricular myocytes and ventricular myocytes from normal and cardiomyopathic neonatal hamster. All three preparations expressed two types of Ca2+ channels: a rapidly activating and inactivating current T-type ICa, and a more slowly activating and inactivating Ca2+ current L-type. Typically, the T-type Ca2+ currents had V0.5 values 20 to 30 mV more negative than the L-type counterpart. Therefore, they could be effectively separated from L-type currents by holding the cells at more depolarizing holding potentials (i.e. -50 mV) at which T-type ICa, were almost completely inactivated and L-type ICa, were fully available for voltage activation. In addition, the T-type ICa, current-voltage relationship peaked at potential negative relative to that of ICa,L: -20 to -10 mV as opposed to +10 to +20 mV for the L-type ICa. The T- and L-type ICa, in 10-day-old chick embryo heart and fetal human ventricular myocytes were sensitive to mM ammounts of the inorganic Ca2+ blocker Mn2+. On the other hand, micromolar concentrations of Cd2+ blocked ICa,L in all preparations tested, while micromolar concentrations of Ni2+ appeared to selectively block ICa,T. Dihydropiridine (DHP) Ca2+ -antagonists, nifedipine and PN 200-110 selectively blocked ICa,L with K1/2 of 5 to 10 µM depending on extracellular [Ca2+]. Raising the extracellular Ca2+ concentration had a dramatic, allosteric-like effect on PN 200-110 action, reversing the DHP block and shifting the dose dependence of blockade to higher drug concentrations. The recently described antiasmatic agent, azelastin, was shown to block ICa,L at nanomolar concentrations. However, at these concentrations azelastin produced large activation of T-type ICa. The bee venom, apamin, was shown to selectively and completely block ICa,L at 1010M . The effect of apamin was similar in both 10-day-old chick embryo heart cells and fetal human ventricular myocytes. To our knowledge, apamin is the first naturally occurring toxin described that is both selective and potent blocker of ICa,L . The local anesthetic, bupivacaine, was shown to be a potent but non-selective blocker of ICa,L in 10-day-old chick embryo heart cells. This observation may explain the known cardiotoxic action of this drug. Potassium channel opener, cromakalim, was shown to induce up to 2 fold increases in Ica T at 10 8m without having a significant effect on ICa,L Therefore, this observation may explain the arrhythmic action of this drug. Activators of cAMP dependent protein kinase (PKA) have been shown to stimulate ICa,L in 10-day-old chick embryo heart single cells. Although, the stimulation is largely temperature sensitive. No effect of PKA activators: 8 Br-cAMP, isoproterenol or forskilin were noted at room temperature. This temperature sensitivity of ICa,L phosphorylation by PKA may explain in part the large Q10 (3.5) of ICa,L observed in this and other studies. Angiotensin II was shown to potently and reversibly stimulate ICa,T at nanomolar concentrations. An inhibition of ICa,L by ANG II was also noted. The mechanism by which ANG II exerts its action on Ca2+ currents presumably involves protein kinase C. However, more work is needed to completely elucidate the mechanism of ANG II action. The main difference between ICa of normal and cardiomyopathic hamsters is a larger proportion of ICa,T in cardiomyopathic hamsters' myocytes and 10 fold larger window currents of ICa,. in cardiomyopathic hamster ventricular myocytes. This observation may explain in part the additional Ca2+ influx observed in cardiomyopathic myocardium. ICa in Duchenne distrophic skeletal myoballs is also different from that in normal skeletal muscle in that the current-voltage relationship is shifted positively along the voltage axes. A similar shift was noted in the steady state inactivation curve. Also, an increase of the window L-type Ba2+ current was observed in DMD myoballs. Whether these changes reflect a developmental abnormality or genuine molecular changes in ICa,L remains to be established. In conclusion, this study touched on several aspects of L-type and T-type Ca2+-channels modulation by pharmacological agents and phosphorylation. Several novel findings have been described which reflect on the physiology of both normal and abnormal Ca2+- currents