Multifuncionalidad de la adenosina desaminasa de superficie y de sus proteínas de unión

Todos los resultados expuestos en esta Tesis Doctoral sugieren que la ADA de la superficie celular así como sus proteínas de unión tienen un carácter multifuncional. Esto abre nuevas perspectivas en el estudio de la funcionalidad de las proteínas de membrana puesto que los efectos observados tras la activación de una proteína a nivel de membrana tiene que entenderse como el resultado de co-modulaciones no tan sólo, como se consideraba hasta ahora, a nivel intracelular (segundos mensajeros, factores de transcripción) sino a nivel de la propia membrana plasmática. Esta afirmación tiene su base en las siguientes observaciones:El receptor Al de adenosina pertenece a la familia de receptores acoplados a proteínas G (GPCR). La desensibilización inducida por agonistas como un mecanismo regulador de los GPCR ha sido bien caracterizada a nivel farmacológico y molecular pero poco se conoce acerca de las vesículas implicadas en la endocitosis de estos receptores, especialmente para el caso del receptor A(l) de adenosina. La ruta principal de internalización descrita para los receptores acoplados a proteínas G es la vía endocítica clásica en la que participan las vesículas recubiertas de c1atrina. Sin embargo, son muchas las vesículas endocíticas descritas en la literatura por lo que no puede descartarse la participación de otro tipo de vesículas no revestidas de clatrina en el proceso de internalización de los GPCR. Nuestro grupo de investigación ya había demostrado en un células de musculatura lisa de hámster (DDT1-MF2) la interacción entre la ADA de superficie y el RA1, así en primer lugar estudiamos si este era un hecho generalizable a otros sistemas y puesto que también conocíamos que la ADA acelera el proceso de desensibilización e internalización del receptor estudiamos los mecanismos implicados en la endocitosis de ambas moléculas. En primer lugar hemos demostrado que el receptor A(1) de adenosina funciona como molécula de unión de la ADA de superficie en las células de túbulo proximal de riñón de cerdo LLC-PK1. La activación del receptor con el agonista adenosínico R-PIA induce la internalización de ambas proteínas siguiendo la misma cinética y la misma ruta endocítica en la que están implicadas las caveolas.Estos resultados son un ejemplo de la co-modulación existente entre proteínas de la membrana plasmática. A principios de la década de los noventa Zoli et al, 1993 demostraron que las características de unión de un tipo de receptor acoplado a proteína G puede alterarse ante la estimulación de un tipo distinto de receptor también acoplado a proteína G. En el sistema nervioso central y en especial en los ganglios basales se ha descrito un efecto antagonista entre los receptores de adenosina y los receptores de dopamina. La demostración en nuestro grupo de investigación de que la modulación de distintos aspectos del receptor A(1) de adenosina vía la ADA implica una interacción molecular entre ambas proteínas nos llevó a plantearnos si también los efectos antagonistas entre los receptores de adenosina y los de dopamina son debidos a una interacción molecular a nivel de membrana entre los dos receptores.Se ha demostrado que en fibroblastos de ratón doblemente transfectados con el cDNA de los receptores A(1) de adenosina y D(1) de dopamina y en neuronas corticales de rata ambos receptores forman heterómeros funcionales. Estos complejos receptor-receptor están modulados de forma diferencial por los agonistas adenosínicos y los agonistas dopaminérgicos.Uno de los objetivos del grupo de investigación y en particular de esta Tesis Doctoral es entender el papel multifuncional de la ADA de la superficie celular y de sus proteínas de unión. Nuestro grupo de investigación ya ha caracterizado un sistema en el que la ADA no funciona tan sólo como ecto-enzima sino como molécula moduladora de la funcionalidad del receptor A(1) de adenosina. Saura et al, 1998 han definido un modelo de interacción de la ADA y el receptor A(1) de adenosina según el cual esta interacción provoca un cambio conformacional del receptor de manera que la unión a sus ligandos es más efectiva, se favorece el acoplamiento con la proteína G(i) y consecuentemente la transducción de la señal es más efectiva. Nuestros resultados han demostrado la formación de heterómeros A1R/D1R, por lo que se nos planteó la pregunta de cual sería el papel de la ADA de superficie en estos complejos. Nuestro primer objetivo ha sido caracterizar la distribución de la ADA en dichos heterómeros. Mediante técnicas de inmunocitoquímica hemos demostrado que la ADA de superficie está presente en estos heterómeros codistribuyendo con ambos receptores. El receptor A(1) de adenosina en estos complejos es el único que funciona como molécula de unión de la ADA. Así el tratamiento con el agonista dopaminérgico que induce la agregación del receptor de dopamina y la pérdida de colocalización entre ambos receptores también induce la pérdida de colocafización entre la ADA y el receptor de dopamina. El receptor A(l) de adenosina en estos heterómeros y en su estado de alta afinidad, esto es unido a la ADA, es el que modula de forma antagónica las características de unión del receptor D(1) de dopamina.Hasta el momento hemos descrito distintos papeles de la ADA de la superficie celular todos ellos relacionados con señales intracelulares producidas por la interacción de la ADA con una de sus proteínas de unión, el receptor A(l) de adenosina. La ADA a través de su otra proteína de unión el CD26 presenta además un papel en la comunicación intercelular. El CD26 es también una proteína multifuncional de la membrana plasmática que se expresa constitutivamente en muchos tipos celulares principalmente en células epiteliales de placenta, intestino y riñón. La disposición de estas dos proteínas(ADA y CD26) en la membrana plasmática y su capacidad de interaccionar nos hizo plantear nuestro último objetivo. ¿Puede el sistema ADA/CD26 funcionar como un sistema de moléculas de adhesión? El sistema de adhesión escogido ha sido un sistema formado por linfocitos humanos T y monocapas confluentes de células epiteliales humanas, células CACO-2. Nuestros estudios nos han llevado a concluir que el complejo ADA/CD26 tiene un papel relevante en la adhesión célula-célula. La interacción entre ambas moléculas permite por un lado establecer los primeros contactos célula-célula en el proceso de adhesión y por otro lado la señalización vía CD26 induce la activación de las integrinas que conduce a una efectiva adhesión.Adenosine deaminase (ADA) interacts with A1 adenosine receptors in renal cell line LLC-PK1. In these cells agonist induced internalization of both molecules following the same endocytic pathway mediated by caveolae.In the other hand we have demonstrated that dopamine D1 and adenosine A1 receptors assemble into functionally interacting heteromeric complexes in cell lines coexpressing both receptors and in primary cultures of neurons from rat cerebral cortex. Our results indicate that the D1R/A1R molecular intercation can be modulated by their agonists.Treatment with agonists is usually followed by D1R desensitization, the extend of which depends on agonist efficacy and on the D1R expression system used. In transfected fibroblats cells, the agonist SKF-38393 not lead to a D1R desensitization of the cAMP response. Since the agonist is able to clustering D1Rs these results indicate that clustered 01R are also functionally coupled to adenylate cyclase. The combined treatment with adenosine agonist and dopamine agonist not lead to D1Rs clustering thus, the decrease in 01R function is observed in the basence of receptor aggregation.Our previous work has demonstrated that adenosine deaminase (ADA) is necessary for the identification of the high affinity binding state of A1 adenosine receptor, and therefore for allowing efficient signal transduction. Here we showed that ADA can be detected in the plasmatic membrane and a strong A1 receptor /ADA colocalization is observed. In agreement with the existence of heteromeric complexes including A1R, D1R and ADA, D1 receptors colocalized whit ADA in cotransfeded cells. The results suggest that ADA, by providing the high affinity state of the A1 receptors is essential for the adenosine-mediated modulation of the binding characteristics of D1 receptors.Finally we have demonstrated .the role of cell surface adenosine deaminase (ADA) and CD26, an integral membrane protein that acts as ADA binding protein, in cell to cell adhesion. Moreover the interaction of ADA with CD26 in T cells results in a marked integrin activation. Overall these results suggest that ADA/CD26 module has a relevant role in cell-to cell communication.