Studio dell'effetto del derivato del tiazolo CPTH6, un inibitore delle acetiltransferasi, sullo sviluppo cardiovascolare di zebrafish

ll CPTH6 (3-methyl-cyclopentylidene-[4-(4’-chlorophenyl)thiazol-2yl]hydrazone) è un derivato di sintesi del tiazolo di cui è stata caratterizzata l’attività inibitoria sull’attività di enzimi di istone acetiltransferasi quali pCAF e Gcn5. Il trattamento con il composto CPTH6 determina la riduzione del livello di acetilazione degli istoni H3 e H4, oltre al substrato non istonico α-tubulina, dimostrando inoltre un’attività antitumorale su linee cellulari di diverso istotipo tumorale, mediante l’attivazione del processo apoptotico e dell’autofagia. Dati preliminari ottenuti in collaborazione con la Dott.ssa Daniela Trisciuoglio (CNR, Roma) dimostrano che il composto CPTH6 sia in grado di inibire la crescita e la progressione tumorale in vivo mediante l’inibizione dell’angiogenesi tumorale, ovvero la capacità delle cellule tumorali di indurre la formazione di vasi sanguigni a partire da vasi preesistenti,. un processo che ha un impatto determinante nella crescita del tumore primario e nella sua possibile metastatizzazione. In questo lavoro di tesi, allo scopo di studiare la capacità di CPTH6 di modulare lo sviluppo vascolare, sono stati condotti esperimenti in vivo in cui è stato utilizzato il sistema modello del teleosteo zebrafish . Inoltre in questo organismo è stato recentemente dimostrato come mutanti knockout per Gcn5 e pCAF, enzimi target del composto CPTH6, presentino alterazioni nello sviluppo del sistema cardiaco, come mancato looping cardiaco, bradicardia e presenza di edemi pericardici. Lo studio è stato quindi esteso all’attività della molecola CPTH6 sullo sviluppo cardiovascolare in zebrafish, allo scopo di creare una fenocopia dei modelli KO di Gcn5/pCAF di embrioni di zebrafish in seguito all’esposizione al composto CPTH6 a stadi precoci dello sviluppo. Il piano sperimentale per la preparazione della tesi ha previsto il trattamento degli embrioni di zebrafish con dosi crescenti del composto CPTH6 utilizzando come controllo una soluzione contente solamente il solvente DMSO, alla stessa percentuale utilizzata per disciogliere la molecola. In particolare, le larve a 6, 8 o 24 ore dopo la fecondazione (hpf) sono state esposte ad una soluzione contenente CPTH6 a dosi crescenti comprese fra 1 e 20 µMe 2 µM. In parallelo abbiamo valutato l’effetto del composto CPTH6 anche iniziando il trattamento a tempi più tardivi, esponendo le larve alla molecola a partire da 24 hpf con dosi di CPTH6 pari a 1,2,5,10 e 20 µM. Trattando gli embrioni più precocemente, a partire da 6 hpf, abbiamo osservato come la molecola possa indurre effetti tossici concentrazione-dipendenti, permettendoci di calcolare valori di LC50 pari circa a 4 µM di CPTH6. Tutti gli esperimenti successivi sono stati quindi eseguiti trattando gli embrioni a dosi sub-letali: 1 e 2 µM di CPTH6. Abbiamo successivamente confermato, come atteso, che l’esposizione al trattamento con CPTH6 determina una alterazione nello sviluppo cardiaco. In particolare, abbiamo eseguito esperimenti di ibridazione in situ whole mount, usando sonde antisenso dirette contro cmlc2, un marker ventricolo-atriale che consente di osservare il looping cardiaco. Questa analisi è stata eseguita su larve trattate a partire da 24 hpf e da 6 hpf. In confronto alle larve di controllo, sia negli embrioni trattati a partire da 24 hpf sia in quelle trattate a partire da 6 hpf si osserva un aumento significativo dell’angolo di looping. Le larve trattate con CPTH6 a partire da 6 hpf sono inoltre bradicardiche, come osservato in letteratura nelle larve KO per Gcn5 e pCAF, a conferma che il composto determini alterazione dello sviluppo cardiaco. Tutti gli esperimenti successivi sono stati quindi eseguiti trattando gli embrioni a dosi sub-letali pari a 1 e 2 µM di CPTH6. Per studiare gli effetti di CPTH6 sullo sviluppo vascolare delle larve di zebrafish abbiamo preso in esame le vene sub-intestinali (SIV) trattando gli embrioni con dose 1 e 2 µM di CPTH6 e oppure iniettando 50 µM di CPTH6 in prossimità dello sviluppo delle SIV. I dati ottenuti in entrambi i casi indicano che la molecola è in grado di indurre alterazioni dello sviluppo vascolare, dato che mostrano anomalie nella formazione delle SIV e ramificazioni vascolari anormali (sprouting). Inoltre per valutare l’effetto di CPTH6 sulla funzionalità vascolare abbiamo esteso l’analisi su embrioni della linea transgenica mutante Casper (tg(kdrl:GFP;gata1:dsRed)), caratterizzata da assenza di pigmentazione ed espressione della proteina fluorescente GFP sotto il controllo di un promotore specifico delle cellule endoteliali e della proteina fluorescente nel rosso dsRed negli eritrociti. L’analisi di entrambi i transgeni condotta su embrioni trattaticon CPTH6 a partire da 6 hpf dimostrano la presenza di anomalie di dimensione e alterata circolazione sanguigna sia nei vasi intersegmentali (ISV) che in quelli che irrorano l’occhio. Come precedentemente accennato, dati preliminari ottenuti nel laboratorio della Dott.ssa Trisciuoglio, con cui collaboriamo, suggeriscono dimostrano che CPTH6 possa esplicare un’attività antitumorale mediante l’inibizionesce dell’angiogenesi tumorale, un processo che ha un impatto determinante nella crescita del tumore primario e nella sua possibile metastatizzazione. Questi dati sono stati verificati dal fatto che in esperimenti eseguiti su linee cellulari tumorali, il trattamento con CPTH6 mediante la riduzione riduce significativamente della secrezione della proteina pro-angiogenica VEGF-A e i livelli di espressione del loro suo recettore VEGFR2. Abbiamo voluto quindi verificare se l’effetto del trattamento con CPTH6 sulla vascolarizzazione in zebrafish fosse associato ad una alterazione dell’espressione dei geni vefgaa, vegfab e del recettore vegfr2/kdlr omologhi del VEGF-A e del suo recettore VEGFR2 nelle larve di zebrafish, valutata mediante analisi di PCR quantitativa ma non si assiste riscontranoa cambiamenti cambiamenti dei livelli didell’espressione di in seguito al trattamentovefgaa, vegfab e del recettore vegfr2. Inoltre, abbiamo riscontrato un ritardo nella fuoriuscita delle larve dal chorion(hatching) a 72 hpf su larve trattate con CPTH6 a partire da 6 hpf. Questo ritardo potrebbe essere correlato ad una alterazione dello sviluppo del sistema nervoso, suggerito anche dalla microcefalia che caratterizza le larve trattate con CPTH6, la riduzione dell’espressione di marker di specificazione neurale e la riduzione della locomozione osservate delle larve in seguito a trattamento.. In conclusione, i dati ottenuti indicano che il trattamento con CPTH6 è in grado di alterare lo sviluppo del sistema cardio-circolatorio di zebrafish sia a livello della formazione di vasi che a livello del sistema cardiaco.e Dati dati preliminari suggeriscono un effetto del CPTH6 anche sullo sviluppo neurale. Si potrebbero quindi identificare diversi pathway molecolari coinvolti nello sviluppo di zebrafish e conservati nelle linee cellulari tumorali umane, i quali verrebbero alterati in seguito a trattamento con il composto CPTH6, suggerendo un ruolo determinante della acetilazione nella loro modulazione