Les glycosaminoglycannes : implication dans la régénération tissulaire après ischémie et utilisation de mimétiques comme agents potentialisateurs des progéniteurs endothéliaux humains pour la régénération vasculaire

Glycosaminoglycans: involvement in tissue regeneration after ischemia and use of mimetic molecules as potentiating agents of human endothelial progenitor cells for vascular regenerationScientific background: Vascular diseases are the leading causes of death in the world. Among them, critical limb ischemia often leads to amputation of the limb and potential mortality. Current therapies including life style management, pharmacological control of risk factors and surgical revascularization do not completely reverse the pathology. Late-outgrowth endothelial colony-forming cells (ECFC) display high proliferative potential, form vessels in vivo and are incorporated into pre-existing vascular networks. Thus, these cells are considered as a promising therapeutic tools for vascular repair. However, the use of ECFC in cell therapy is limited by their rarity in blood. In addition, clinical trials using cell therapy have demonstrated promising results, but there are still a significant problem with poor cell retention and survival. This underlines the relevance to better knowing the microenvironment on which therapeutic cells are transplanted. Microenvironment is in part composed by sulfated glycosaminoglycans (GAG), such as Heparan Sulfate (HS) or Chondroitin Sulfate (CS). GAG interact with proteins to strengthen the structure and stability of the extracellular matrix. GAG have also functional roles since they regulate numerous biological processes through their abilities to interact with heparin-binding growth factors (HBGF).Objectives: The aim of this thesis was (1) to improve production of ECFC and optimize their endothelial properties in vitro using a GAG mimetic molecule, (2) to characterize structurally and functionally endogenous GAG, especially HS and CS species, in ischemic muscle.Results: (1) We demonstrate that the addition of a GAG mimetic molecule, namely the [OTR4131] compound, during the isolation process of ECFC from cord blood induces a 4 fold increase the number of colonies. Moreover, addition of [OTR4131] to cell culture media improves adhesion, proliferation, migration and self-renewal of ECFC. (2) Ischemia induces modifications of expression of GAG biosynthetic enzymes in muscle, leading to changes in HS and CS structures in distinct ways. These changes are correlated with functional modifications of GAG to bind HBGF and to modulate cell activity. Moreover, CS constitute a persistent hallmark of injury after ischemia.Conclusion & Perspectives: (1) The [OTR4131] GAG mimetic should enable optimization of the expansion capacity and the endothelial properties of ECFC for further therapeutic applications. (2) Intense GAG remodeling follows ischemia and disrupts growth factors activities. The control of CS is a promising new therapeutic approach for the treatment of skeletal muscle injury.Keywords: angiogenesis, endothelial progenitor cell, glycosaminoglycans, heparin binding growth factor, ischemia, muscle regeneration, vascular repairLes glycosaminoglycannes : implication dans la régénération tissulaire après ischémie et utilisation de mimétiques comme agents potentialisateurs des progéniteurs endothéliaux humains pour la régénération vasculaire. Contexte scientifique : Les pathologies vasculaires représentent la première cause de décès dans le monde. Parmi elles, l'ischémie chronique des membres inférieurs conduit fréquemment à une amputation du membre et est associé à une forte mortalité. Les thérapies actuelles, incluant un meilleur mode de vie, les traitements prophylactiques et les interventions chirurgicales ne permettent pas de soigner définitivement les patients. Les progéniteurs endothéliaux circulants (PEC) présentent une capacité de prolifération très élevée, forme des vaisseaux in vivo et s'intègre naturellement à des réseaux vasculaires préexistants. C'est pourquoi, ces cellules sont actuellement considérées comme un outil thérapeutique prometteur pour la réparation vasculaire. Cependant, l'utilisation des PEC en clinique est limitée par leur rareté dans le sang. De plus, les essais cliniques en thérapie cellulaire ont jusqu'à maintenant démontré des résultats prometteurs mais systématiquement limités dans le temps, à cause d'une faible rétention et d'une mort accrue des cellules après injection. Ceci souligne l'importance d'une meilleure compréhension du microenvironnement dans lequel les cellules thérapeutiques sont injectées. Le microenvironnement est en partie constitué par des glycosaminoglycannes (GAG) sulfatés, tels que les Héparanes Sulfates (HS) ou les Chondroïtines Sulfates (CS). Les GAG interagissent avec des partenaires protéiques afin de structurer et de stabiliser la matrice extracellulaire. Les GAG ont également un rôle fonctionnel puisqu'ils régulent de nombreux processus biologiques grâce à leur capacité d'interaction avec des facteurs liant l'héparine.Objectifs: Les objectifs de cette thèse étaient (1) d'améliorer l'isolement des PEC et d'optimiser leurs fonctionnalités endothéliales in vitro à l'aide d'un mimétique de GAG, (2) de caractériser d'un point de vue structurel et fonctionnel les GAG endogènes, et en particulier les HS et les CS, dans le muscle ischémié.Résultats: (1) Nous avons démontrés que l'ajout d'un mimétique de GAG, et plus précisément le composé [OTR4131], pendant les phases d'isolement des PEC à partir du sang de cordon induisait un enrichissement par 4 du nombre de colonies. De plus, l'ajout de ce mimétique dans le milieu de culture permet d'optimiser l'adhérence, la prolifération, la migration ainsi que l'auto-renouvellement des PEC. (2) L'ischémie induit une modification de l'expression des gènes de biosynthèse des GAG, conduisant à des modifications structurelles distinctes des HS et CS. Ces modifications sont corrélées avec des changements dans la capacité des GAG à lier certains facteurs et à moduler l'activité cellulaire. De plus, les CS forment une marque cicatricielle après ischémie.Conclusion & Perspectives: (1) Le mimétique de GAG [OTR4131] devrait permettre d'optimiser les capacités d'expansion des PEC et leurs propriétés endothéliales pour une application thérapeutique. (2) Un intense remodelage des GAG suit l'accident ischémique et perturbe l'activité des facteurs de croissance. Le contrôle des CS constitue une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement des lésions du muscle squelettique.Mots-clés : angiogenèse, progéniteurs endothéliaux circulants, glycosaminoglycannes, facteurs liant l'héparine, ischémie, régénération musculaire, réparation vasculair