Transformación de cloroplastos de lechuga con tres genes sintéticos de protegrinas con actividad antimicrobiana

Tesis (Maestría en Ciencias en Biología Molecular)"Las enfermedades infecciosas son una de las principales causas de mortalidad a nivel mundial. El uso indiscriminado de antibióticos para combatir estas enfermedades ha provocado que los microorganismos desarrollen resistencia a una gran cantidad de antibióticos, motivo por el cual es necesario contar con nuevas estrategias para combatirlos. En este contexto, los péptidos antimicrobianos son una alternativa eficaz para combatir microorganismos. El uso de plantas transgénicas para la producción de proteínas de importancia farmacéutica es una excelente alternativa biotecnólogica. Dentro del área de la transformación genética de plantas, en los últimos diez años ha sido posible introducir genes foráneos al genoma del cloroplasto. Esta tecnología emergente cuenta con ventajas respecto a la transformación nuclear tales como: ausencia de flujo de transgenes mediante polen; altos niveles de expresión de proteína heteróloga (hasta 20% de la proteína total soluble); y no conocen efectos epigenéticos. Particularmente en el caso de los péptidos antimicrobianos se han reportado buenos resultados de plantas transgénicas con genes sintéticos que confieren resistencia contra bacterias y hongos. En el presente trabajo se realizaron construcciones bicistrónicas de tres genes que codifican para petidos antimicrobianos de origen porcino conocidos como protegrinas (PG1, PG3cc, PGIB367), las cuales se clonaron en dos vectores para la transformación de cloroplastos de tabaco y lechuga: pKCZ y pADCt respectivamente. En pruebas preliminares de expresión de los genes bicistrónicos en Eschericha coli, resulto en un evidente funcionalidad del promotor y de la expresión del gen selección a espectinomicina y del gen de la protegrina. Se realizó la transformación exitosa de callos de lechuga mediante biobalística, y después de dos meses y medio de resiembra en medio de selección, se obtuvieron callos transplastómicos de lechuga que fueron corroborados por análisis por PCR de dos genes bicistrónicos, demostrándose la integración del genoma del cloroplasto, para las protegrinas PG1 y PG3cc. La PGIB367 se encuentra en forma de callo en medio selectivo. A la fecha se ha observado una tendencia de un mayor porcentaje de regeneración en las construcciones específicas de especie y estamos analizando los brotes para concluir con cual de los vectores se favorece la transformación de cloroplastos