Desarrollo de un método molecular para la caracterización funcional rápida de promotores de geminivirus.

Tesis (Maestría en Ciencias en Biología Molecular)"Los geminivirus son un grupo muy diversificado de fitopatógenos que, además de ser excelentes modelos para estudiar la replicación del DNA en plantas, han sido utilizados como fuente de secuencias reguladoras para la ingeniería genética de plantas, y como vectores de expresión para la producción de vacunas en células vegetales. El reciente hallazgo de un promotor geminiviral que es 5 veces más potente que el DNA regulador más ampliamente utilizado en la biotecnología de plantas, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV, un caulimovirus), ha estimulado el interés por conocer las propiedades funcionales de otros promotores de geminivirus con miras a su eventual uso tecnológico. En el presente trabajo hemos desarrollado una sencilla pero poderosa metodología basada en la técnica de la PCR, que permite amplificar de manera específica a la Región Intergénica (RI) de prácticamente cualquier geminivirus de dicotiledóneas conocido. Esta región viral contiene dos promotores divergentes con propiedades funcionales muy diferentes, pRep y pCP en el genoma A, y pBC1- pBV1 en el genoma B. El método desarrollado involucra el uso de tres pares de iniciadores universales: uno que hace posible la amplificación de la RI del genoma A de los begomovirus del Nuevo Mundo, de cerca de 400 pb; otro que amplifica la región análoga de los begomovirus del Viejo Mundo (Asia, Europa, Africa y Australia), tanto monopartitas como bipartitas; y un tercer par que amplifica la RI del componente genómico B de los begomovirus del continente americano, generando un producto de PCR de cerca de 900 pb. Los iniciadores están diseñados con un sitio de restricción común, el cual permite la clonación del producto de PCR en un vector que contiene un gen reportero sin promotor (pBS-X-Gus), especialmente construido para hacer factible, en un solo paso de clonación molecular, la generación de dos cartuchos de expresión alternativos, Rep-GUS y CP-GUS en el caso del genoma A, o BC1-GUS y BV1-GUS en el caso del genoma B. Mediante este nuevo procedimiento logramos generar 22 vectores de expresión, 16 de los cuales se derivaron de los genomas A de 8 begomovirus de América (algunos de ellos recientemente descubiertos), otros 2 del genoma A de un begomovirus bipartita de Africa, 2 más del genoma de un begomovirus monopartita originario del Medio Oriente, y finalmente, 2 del genoma B de un begomovirus de América. La funcionalidad de 10 de estos vectores de expresión se estableció de manera preliminar por medio de ensayos de expresión transitoria, utilizando el método de bombardeo con micropartículas. Estos ensayos llevaron al hallazgo de 2 promotores Rep excepcionalmente fuertes, derivados de begomovirus que han sido solo parcialmente caracterizados al presente. La actividad de estos promotores mostró ser de 3 a 4 veces superior a la de los promotores homólogos de otros begomovirus mejor caracterizados, lo que sugiere que esas secuencias virales pueden tener un uso amplio en la ingeniería genética de plantas. El método desarrollado en el presente trabajo será de gran utilidad para la exploración del potencial biotecnológico de geminivirus de cuatro continentes, y facilitará de modo notable el estudio de los procesos de control transcripcional en virus pertenecientes a esta gran familia viral.""The Geminiviridae is a diverse family of plant viruses that are an excellent model to study the DNA replication process in plants. Moreover it has been used as a source of regulatory sequences in plant genetic engineering and as expression vectors for the production of vaccines in vegetable cells. The recent discovery of a geminiviral promoter 5- fold stronger than that of the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus (CaMV 35S), the most used in plant biotechnology, has stimulated the interest to know the functional properties of other geminiviral promoters to use them in biotechnology. In this work we have develop a simple but powerful methodology based on PCR, that allow to amplify in a specific way the intergenic region (IR) of almost every known begomovirus. This viral region contains two divergent promoters with very different functional properties, pRep and pCP in genome A, and pBC1- pBV1 in genome B. This method includes the use of three pairs of universal primers: one amplifies the IR of genome A of Begomovirus of the New World, from about 400 pb, another one amplifies the analogue region of begomovirus from the Old World (Asia, Europe, Africa and Australia), both monopartites as bipartites; and a third pair that amplifies the IR of genome B of American begomovirus from about 900 pb. Primers were designed with a common restriction site that allow cloning the PCR product in a vector with a reporter gene without promoter (pBS-X-GUS), specially constructed to make feasible two alternatives expression cassettes in just one step of molecular cloning, Rep-GUS and CP-GUS for genome A, or BC1-GUS and BV1-GUS for genome B. With this new procedure we got to generate 22 expression vectors, 16 of genome A from 8 American begomovirus (some of them recently discovered), 2 of genome A from a bipartite African begomovirus, 2 of the unique genome from a monopartite begomovirus from Middle East, and finally, 2 of genome B from an American begomovirus. The functionality of these expression vectors was established in a preliminary way by transient expression assays using the particle bombardment method. The methodology that is described here will be of great utility to explore the biotechnological potential of begomovirus from four continents, and will facilitate the study of the process of transcriptional control in viruses from diverse lineages of this large viral family.