Expresión en tomate de un polipéptido antigénico con epítopos de 3 exotoxinas bacterianas (DPT) codificado por un gen sintético.

Tesis (Doctorado en Ciencias en Biología Molecular)."Una prioridad actual en el campo de vacunas es el desarrollo de vacunas de subunidades y multicomponentes que no produzcan reacciones adversas y protejan contra varios patógenos. Los problemas de salud causados por las exotoxinas de Corynebacterium diphteriae, Bordetella pertussis y Clostridium tetani van desde síntomas leves hasta la muerte. El presente trabajo se enfoca al desarrollo de una vacuna comestible contra la difteria, tos ferina y tétanos en plantas. Se transformó genéticamente a plantas de tomate por medio de Agrobacterium tumefaciens portador de un gen sintético optimizado para plantas el cual codifica para un polipéptido novedoso que contiene dos adyuvantes y seis epítopos inmunoprotectores de las toxinas DPT, unidos por péptidos conectores. Se verificó la integración del gen sintético DPT (sDPT) por PCR en las plantas transgénicas de tomate y se confirmó por Southern blot observándose de 1-2 copias del gen en diversas líneas. Asi mismo se detectó un transcrito específico del tamaño esperado (570 pb) por RT-PCR. El polipéptido codificado por el gen sDPT fue detectado por inmunoensayos in vitro con anticuerpos específicos, con valores equivalentes a 1.9-5.8 μg/g de toxoide diftérico, 0.0003-0.15 μg/g de toxoide pertúsico y 4.5-16.8 μg/g de toxoide tetánico en hojas de tomates transgénicos. Además, se observó que la proteína recombinante expresada en las plantas de tomate fue capaz de inducir anticuerpos específicos en animales.Ratones Balb/c fueron inmunizados por vía oral con el tejido vegetal en tres dosis semanales. En el suero analizado se encontró respuesta del tipo IgG a las exotoxinas diftérica, pertúsica y tetánica inducida por el polipéptido sintético. En el fluído traqueopulmonar se observó una modesta respuesta del tipo IgG. Una respuesta alta del tipo IgA hacia el epítope tetánico fue evidente en los lavados intestinales. Los niveles de respuesta en estos grupos fueron más altos que en el grupo de ratones alimentado con tomate no transformado. Estos resultados sugieren que la proteína recombinante DPT expresada en plantas de tomate puede inducir anticuerpos específicos in vivo y faltaría retar con las toxinas a ratones preinmunizados con tomates que contenienen el gen sDPT para ver si existe protección. Este es el primer reporte de la expresión de un polipéptido codificado por un gen no presente es la naturaleza, con secuencias antigénicas de las exotoxinas diftérica, pertúsica y tetánica, en un sistema vegetal y podria ser utilizado como una vacuna comestible práctica contra la difteria, tos ferina y tétanos. Este trabajo prueba además, que es posible diseñar genes que codifiquen multiepítopos que induzcan inmunidad protectora en ratones.""A current priority of vaccinology is the development of subunit and multicomponent vaccines which protect and avoid secondary effects. The health problems caused by the exotoxins of Corynebacterium diphteriae, Bordetella pertussis and Clostridium tetani range from light symptoms to death. We have attempted to develop an edible vaccine against diphtheria, pertussis and tetanus in plants. By means of Agrobacterium mediated transformation we generated transgenic tomatoes with a plant-optimized synthetic gene encoding a novel polypeptide containing two adjuvant and six DPT immunoprotective exotoxin epitopes joined by peptide linkers. We detected the integration of the synthetic DPT (sDPT) gene by PCR in transformed tomato plants and confirmed it by Southern blot observing 1-2 copies of the gene in diverse plants. A specific transcript of the expected molecular size (570 bp) was detected by RT-PCR. In addition we detected a polypeptide encoded by the sDPT gene by immunoassay in vitro, with specific antibodies with average values of 1.9-5.8 μg/g of diphtheria toxoid, 0.0003-0.15 μg/g of pertussis toxoid and 4.5-16.8 μg/g of tetanus toxoid in leaves of transgenic tomatoes. We also assayed if the recombinant protein expressed in tomato plants could induce specific antibodies in animals. Balb/c mice were immunized by the route with the plant material in three weekly doses. Sera tested for IgG antibody to pertussis, tetanus and diphtheria toxin showed responses to the synthetic polypeptide. In the tracheopulmonary fluid a modest IgG response was observed. High IgA response against tetanus toxin was evident in gut washes. The levels of response in these groups were higher than those of mice that had been fed with wild-type tomatoes. Our results suggest that the recombinant DPT protein expressed in tomato plants induces specific antibodies in vivo. Challenge with toxins in mice previously immunized with the tomatoes containing sDPT wood be needed to test for protection. This is the first report of the expression of a polypeptide encoded by a gene, which does not exist in nature,l containing diphteria, pertussis and tetanus exotoxin antigen sequences in plants, and may be used as a practical edible vaccine against diphtheria, pertussis and tetanus. Our work also demonstrates that it is possible to design genes encoding multiepitopes polipeptides that induce protective immunity in mice.