Caracterización bioquímica y estructural del factor de transcripción Clp y del complejo Clp/ADN

"Las bacterias del género Xanthomonas son de un alto interés agrícola y económico, a causa de que son bacterias fitopatógenas y por lo tanto responsables de enfermedades en plantas como la podredumbre negra o cáncer, en cultivos como tomates, pimientos, cítricos o frutas, entre otros. Estas bacterias poseen un factor de transcripción global de virulencia llamado Clp el cual es un homólogo estructural de la proteína activadora por catabolito (CAP, también conocida como CRP) de ahí que reciba el nombre de Clp, por sus siglas en inglés CRP like protein. Clp es de interés en la súper familia CRP/FNR debido a que puede unirse a ADN sin necesidad de un ligando y cuando su une a éste, que es c-di-GMP, Clp es inhibido, caso contrario a su homólogo CAP. Es de un gran interés conocer el mecanismo por el cual Clp reconoce e interacciona con su sitio de unión en el ADN y de igual forma con c-di-GMP. En el presente trabajo se expresó Clp en la cepa BL21 (DE3) Star de Escherichia coli, y se evaluaron las condiciones para una mejor expresión de la proteína recombinante. Mediante la técnica de desplazamiento térmico se identificó un amortiguador que le proporciona mayor homogeneidad y estabilidad térmica y conformacional a la proteína recombinante. La purificación se realizó mediante dos pasos cromatográficos el primero por IMAC y el segundo por afinidad a Heparina. Se realizaron ensayos de cristalización tanto de la proteína recombinante como en complejo con ADN, utilizando la técnica de difusión de vapor en gota sentada. Con los cristales obtenidos para Clp, se realizaron experimentos de difracción de rayos X, obteniendo un patrón de difracción de 2.6Å de resolución con el cual se resolvió su estructura.""Bacteria of the genus Xanthomonas are of high agricultural and economic interest, because they are phytopathogenic and therefore responsible for diseases in plants such as black rot or cancer in crops such as tomatoes, peppers, citrus or fruit, among others. These bacteria have a global virulence transcription factor called Clp which is a structural homologue of the catabolite activating protein (CAP) or also known as CRP hence it is called Clp, for its acronym in English CRP like protein. Clp is of interest in the CRP / FNR super family because it can bind to DNA without the need for a ligand and unlike its more-studied homologue CAP the binding to its ligand (c-di-GMP) only causes its inhibition. It is of great interest to know the mechanism by which Clp recognizes and interacts with its binding site in DNA and in the same way with c-di-GMP. In the present work, Clp was expressed in strain BL21 (DE3) Star of Escherichia coli, the conditions for a better expression of the recombinant protein were evaluated. By means of the thermal displacement technique, a buffer was identified that provides greater homogeneity and thermal and conformational stability to the recombinant protein. The purification was carried out by means of two chromatographic steps, the first by IMAC and the second by affinity to Heparin. Crystallization tests were carried out on both the recombinant protein and on the DNA complex, using the technique of vapor diffusion in sitting drop. Several crystals were tested in X-ray diffraction experiments, a complete dataset was collected from a single crystal and the structure of apo Clp was obtained at 2.6Å.