Efecto de fármacos epigenéticos sobre la inducción de genes de pluripotencia en células somáticas humanas

Tesis (Maestría en Ciencias en Biología Molecular)"La generación de células pluripotentes inducidas (iPSCs) por la expresión ectópica de los factores POU5F1 (OCT4), SOX2, KLF4, C-MYC, NANOG y LIN28 ha establecido oportunidades de implementar terapias en el área de medicina regenerativa. Sin embargo, su aplicación clínica está limitada por el uso de vectores virales. Por otro lado, existen fármacos capaces de modificar el epigenoma incrementando la plasticidad celular. El presente trabajo evaluó el efecto de los fármacos epigenéticos sobre la expresión de genes de pluripotencia en células somáticas humanas. Inicialmente, se realizó un ensayo de viabilidad para evaluar la citotoxicidad de los fármacos epigenéticos ácido valproico, hidralazina, talidomida, isotretinoina, ribavirina y azacitidina en una línea celular de fibroblastos dérmicos humanos. Posteriormente, se cultivaron las células humanas en presencia de los fármacos epigenéticos en conjunto con un cóctel de moléculas potenciadoras del proceso de reprogramación. Se comprobó que los fármacos epigenéticos individuales o combinados no causaron una disminución en la viabilidad de los fibroblastos humanos., aunque en combinación con el cóctel de moléculas el efecto citotóxico aumento drásticamente. A consecuencia de esto, se eligió la azacitidina, y el ácido valproico en conjunto con el cóctel de potenciadores de reprogramación con la finalidad de evaluar la expresión de los genes relacionados con la pluripotencia por RT-qPCR. La exposición de los fibroblastos humanos al ácido valproico, azacitidina junto con el cóctel de potenciadores de la reprogramación no fue suficiente para inducir cambios morfológicos, característicos de la transición mesenquimo-epitelio o la activación de los genes relacionados con la pluripotencia. Estos datos sugieren que la modificación de la estructura de la cromatina por el efecto del ácido valproico y azacitidina es solo una parte de una serie de eventos que deben realizarse para inducir la expresión de factores de pluripotencia.""Generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) by ectopic expression of POU5F1 (OCT4), SOX2, KFL4, C-MYC, NANOG and LIN28 has established new opportunities in stem cell research, drug discovery and disease modeling. Nevertheless, genomic integration of viral vectors reduced their clinical applications. On the other hand, there are drugs that increase cell plasticity by modifying the epigenome, among them are valproic acid, hydralazine, thalidomide, isotretinoin, ribavirin and azacytidine. The aim of this study was to evaluate the effect of epigenetic drugs on the expression of pluripotency-related genes in human somatic cells. First, we performed a viability assay to assess the cytotoxicity of the epigenetic drugs in a human cell line. Afterwards, we cultured the human cells in presence of all the epigenetic drugs which we tested. Our results indicate a low cytotoxic effect by the presence of sole and combined epigenetic drugs, although not with the cocktail of reprogramming enhancers. Then, we chose valproic acid, azacytidine, and the cocktail of reprogramming enhancers in order to evaluate the expression of pluripotency-related genes by qPCR. Exposure of the human fibroblasts to valproic acid, azacytidine, and a cocktail of reprogramming enhancers was not enough to induce morphological changes, characteristic of the MET transition, or activation of the pluripotency-related genes. These data suggest, that the modification of the chromatin structure by the effect of valproic acid and azacytidine is only one part of a series of events that must be carried out to induce the expression of pluripotency factors.