Delimitación de secuencias involucradas en el silenciamiento y trasactivación de los genes tardios del Virus Huasteco del Chile (PHV).

Tesis (Maestría en Ciencias en Biología Molecular)"El virus huasteco del chile (PHV) es un miembro de la familia Geminiviridae, la cual comprende virus de plantas con un genoma de ADN circular de cadena sencilla y una cápside con apariencia geminada. Varias líneas de evidencia indican que los geminivirus siguen programas de regulación temporal en la expresión de sus genes, al igual que la mayoría de los virus conocidos. Estudios previos han permitido identificar algunos elementos cis-reguladores que controlan la transcripción de los llamados “genes tardíos”. Uno de ellos es el llamado “elemento tardío conservado” (CLE) que funciona, aparentemente, como un blanco funcional de la proteína viral TrAP, involucrada en la transactivación de los genes CP (proteína de la cápside) y BV1, y otro elemento relevante es un silenciador que funciona de manera atípica, con actividad restringida al promotor CP. La presente investigación está orientada a analizar las secuencias reguladoras del promotor CP de PHV, especialmente el silenciador localizado en una región codificante del virus, así como a la caracterización funcional de algunos elementos conservados en los promotores CP de begomovirus. Para esto se construyeron casetes de expresión compuestos por el gen reportero GUS bajo el control de diversos promotores híbridos de origen viral, los cuales fueron integrados en dos clases de vectores: unos apropiados para ensayos de expresión transitoria en células vegetales, construídos previamente por Gómez-Castañón (2004), y otros para la transferencia del casete de expresión al genoma de las plantas mediante Agrobacterium tumefaciens, generados en este trabajo. A fin de delimitar el elemento silenciador del gen CP, fragmentos progresivamente menores de la región genómica de PHV donde dicha actividad ha sido mapeada se colocaron corriente arriba de un promotor CP truncado (-697 a +24), que es activo en tejido vascular. De este modo fueron creados seis vectores binarios que fueron transformados a Agrobacterium tumefaciens y serán utilizados para generar plantas transgénicas de tabaco. Se construyó además un vector binario en el que el silenciador del virus del mosaico dorado del tomate (TGMV), se fusionó al promotor CP de PHV, para determinar si ese silenciador viral tiene un efecto funcional sobre un promotor heterólogo.""Pepper Huasteco Virus (PHV) is a member of the Geminiviridae family, which groups plant viruses with circular ssDNA genomes and a geminate capsid morphology. Several lines of evidence indicate that geminiviruses follow temporal regulation programs of gene expression, like most of known viruses. Previous studies have allowed to identify some cis-regulatory elements involved in transcription control of “late genes”. One of them is the “Conserved Late Element” (CLE), which apparently works as a functional target of TrAP, a virus-encoded protein involved in transactivation of both CP (encoding the capsid protein) and BV1 genes. The other one is a transcriptional silencer which activity is restricted to the CP promoter in vascular tissues. The aim of this work is to analyze regulatory sequences of the PHV CP promoter, especially the silencer element located in a virus coding region, as well as functional characterization of some conserved elements in CP promoters of begomoviruses. For this purpose, we constructed a series of expression cassettes made up of the GUS reporter gene under the control of diverse hybrid promoters of viral origin, which were integrated into two kind of vectors: ones appropriate for transitory expression assays in vegetal cells, previously constructed by Gómez-Castañón (2004), and others for transfer of expression cassettes to the plant genome by an Agrobacterium tumefaciens-based system, which were generated in this work. In order to delimit the silencer element of the CP gene, progressively smaller fragments of a PHV genomic region where the silencer activity was previously mapped were placed upstream of a truncated CP promoter (-697 to +24), that is active in vascular tissues. In this way six binary vectors were created, whcih were transformed into Agrobacterium tumefaciens, and will be further employed to generate tobacco transgenic plants. In addition, a binary vector was constructed in which the silencer of Tomato golden mosaic virus (TGMV), was fused to the CP promoter of PHV, to determine if this silencer element has a functional effect on a heterologous viral promoter. Finally, expression vectors for both transitory assays and stable expression systems were generated; these vectors contained synthetic promoters with either CLE multimers or different combinations of evolutionarily conserved elements of begomovirus CP promoters, denominated “Conserved Modular Arrangements” (CMAs).