Caracterización molecular y funcional de genes que codifican proteínas de choque térmico de plantas bajo condiciones de estrés abiótico

Tesis (Maestría en Ciencias en Biología Molecular)"Actualmente las actividades antropogénicas tienen un gran impacto sobre el planeta, las cuales están provocando alteraciones en el clima y una contaminación ambiental importante. Lo anterior se debe principalmente al uso indiscriminado de combustibles fósiles, el uso de aerosoles, la deforestación masiva, entre otros, las cuales han intensificado considerablemente las emisiones de CO2, causando el calentamiento global. Además, la escasez del agua dulce el cual es uno de los principales factores limitantes para la productividad agricola, junto con la calidad de los suelos agrícolas que cada día son más pobres y están más contaminados debido al uso inadecuado y mal manejo de la agricultura tradicional. Como resulta difícil que las plantas se adapten a todos los cambios que está sufriendo el planeta, es de suma importancia estudiar y comprender los mecanismos involucrados en la respuesta de las plantas al estrés abiótico.. Por lo que el ampliar la información a nivel básico sobre los procesos moleculares generará nuevos conocimientos que serám claves para la obtención de plantas más tolerantes al estrés. Uno de los principales mecanismos de tolerancia al estrés, es la síntesis de chaperonas moleculares, como son las proteínas de choque térmico (HSPs). Estas proteínas son esenciales para la síntesis, la protección, el transporte, el plegamiento o el replegamiento y la degradación de proteínas parcialmente o completamente desnaturalizadas bajo condicones normales y en condiciones de estrés. Nuestro grupo de investigación ha construido bibliotecas sustractivas (SSHs) como por ejemplo de frijol (Phaseolus vulgaris) bajo estrés salino, y bibliotecas de cDNA de nopal (Opuntia streptacantha) bajo diferentes condiciones de estrés abiótico, en donde hemos identificado una serie de genes relacionados de la respuesta al estrés que son interesantes para su estudio. En dichas bibliotecas hemos seleccionado genes que codifican para chaperonas moleculares como las proteínas de choque térmico (HSP), para su caracterización funcional en Arabidopsis thaliana. El propósito de este estudio fue caracterizar molecular y funcionalmente HSPs, tales como las proteínas DnaJ (HSP40) de A. thaliana y un gen de nopal (O. strptacantha) que codifica para una proteína de choque térmico de bajo peso molecular (sHSP), bajo condiciones de estrés abiótico. Para la caracterización de los genes DnaJ de A. thaliana, el primer paso fue la genotipificación de las líneas insercionales de T-DNA de los genes At5g22060 (AtDJ2) y At3g44110 (AtDJ3) para obtener mutantes insercionales sencillas de cada ge. Dichas mutantes sencillas presentan un fenotipo de sensibilidad en germiniación bajo condiciones de estrés salino. A partir de estos resultados, generamos una doble mutante (atdj2-atdj3-46), en el cual obtuvimos un fenotipo de mayor sensibilidad en cuanto a la velocidad de germinación bajo condiciones de estrés salino, comparándola con las líneas mutantes sencillas y el ecotipo parental (Col-0). También nos enfocamos en realizar experimentos de ganancia de función, mediante la obtención de una línea sobreexpresante de uno de los DnaJ (AtDJ2), del cual construimos el vector para dicha sobreexpresión en A. thaliana, y hasta el momento contamos con semillas transformadas para identificar líneas transgénicas resistentes al marcador de selección del vector, para posteriormente, caracterizar su fenotipo bajo condiciones de estrés. Para la caracterización de la DnaJ (AtDJ2) realizamos la construcción de un vector para el sistema de dos híbridos, que nos permitirá identificar posibles blancos de interacción o ligandos de esta proteína. En lo que respecta a la caracterización del gen OpsHSP18 de nopal que codifica para una sHSP de 18KDa, nos planteamos sobreexpresario en A. thaliana para caracterizar las líneas transgénicas bajo condiciones de estrés. Dos líneas transgénicas (OpsHSP18-over3 y OpsHSP18-over7) se sometieron a estrés salino (150mN de NaCI) junto con plántulas del ecotipo parental Col-0 durante 15 días, en donde se observó un menor daño entre lineas que sobreexpresan las OpsHSP18 de nopal con respecto a las plantas de control. De manera interesante, al momento de realizar los experimentos de recuperación, los cuales consisten en pasar las plántulas a tierra son aplicación de estrés salino, se observó una mayor tolerancia de las líneas transgénicas, logrando hasta un 70% de supervivencia en comparación con un 20% en la parental Col-0. Con base a los resultados obtenidos durante este estudio, podemos señalar que ambas chaperonas moleculares de la familia HSP están involucradas en la respuesta al estrés salino, sugiriendo que podrían estar participando en la protección de proteínas cuando la semilla o la plántula está sujeta a condiciones de salinidad.""Currently, anthropogenic activities have an important impact on the planet, causing climate changes and pollution of the environment. These changes are mainly by the indiscriminate use of fossil fuels and aerosols, massive deforestation, among others, which have intensified CO2 emissions causing global warming. In addition, water deficiency, which is one of the major limiting factors of agricultural productivity; as well as the soil quality, which is continuously polluted and degraded by the inadequate management of conventional agriculture. Since it is becoming difficult for plants to adapt to all changes taking place in the world, it is very important to study and understand the mechanisms involved in plant responses to abiotic stress. In this regard, improving the knowledge on the molecular events associated to stress tolerance, will allow the generation of plants even more tolerant to stress. One of the main mechanisms of stress tolerance is the synthesis of molecular chaperones such as heat shock proteins (HSPs). These proteins are essential for the synthesis, protection, transport, folding or refolding, and degradation of partially or completely unfolded proteins under normal and stress conditions. Our research group has constructed a subtractive library (SSHs) of common bean (Phaseolus vulgaris) under salt stress, and a cDNA library of Cactus pear (Opuntia streptacantha) under different abiotic stress conditions. From these libraries, we have identified a group of stress related genes that are attractive candidates for further studies. From these genes, we selected those encoding molecular chaperones such as HSPs for their functional characterization in Arabidopsis thaliana. The aim of this study was the characterization of HSPs at the molecular and functional level, including two DnaJ proteins (HSP40) from A. thaliana and a gene encoding a small heat shock protein from Cactus pear (O. streptacantha) under abiotic stress conditions.