In vitro production of bovine embryo in tubes without gaseous atmosphere control

Com a maior utilização da OPU existe a necessidade de encontrar alternativas para iniciar as primeiras fases da PIV sem controle da atmosfera. O desenvolvimento de um método prático e simples de transporte/maturação/fecundação permitiria maior eficiência do laboratório e diminuição dos custos de produção. O objetivo deste estudo foi desenvolver um método de maturação e fecundação para complexos cumulus oócitos (CCO) em tubos de polipropileno sem gaseificação, mantidos em banho-maria. A maturação in vitro em estufa foi conduzida em TCM-199 modificado (controle) enquanto que para os tratamentos em banho-maria, em tubos, o meio foi acrescido de 25mM de N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido etanosulfônico (HEPES). Na fecundação in vitro dos oócitos em tubos, os CCO foram mantidos em banho-maria a 39°C em Talp-Fert, acrescido de HEPES em concentrações entre 10mM a 28,7 mM por 10 a 18 horas, sob óleo mineral. O cultivo realizou-se em placas em bolsas gaseificadas com meio SOFaaci com soro de vaca em estro (SVE), sob óleo mineral, em estufa com 5,00%CO2 , 5,00%O2 e 90,00% de N2 a 39°C, por 9 dias. Verificou-se que CCO maturados por 24h em tubos não gaseificados, mantidos em banho-maria também podem ser fecundados em meio Talp-Fert com 25 mM de HEPES, em tubos não gaseificados, mantidos em banho-maria durante 10 horas. As taxas de clivagem, blastocistos em D7 e D9 em tubos não gaseificados foram semelhantes (P>0,05) aos procedimentos em estufa. A fecundação em Talp-Fert com 10 mM a 28,7 mM de HEPES em tubos mantidos em banho-maria prejudica o desenvolvimento embrionário quando conduzida por 18 horas.The increase in OPU utilization requires an alternative to start the early phases of PIV without a controlled atmosphere. The development of a practical and simple way to transport/mature/fertilize might enhance the efficiency of the laboratory and consequently decrease its production costs. The aim of this study was to develop a method for cumulus oocytes complexes (CCO) maturation and fertilization in polypropylene tubes without atmosphere control kept in water bath. The in vitro maturation performed with controlled atmosphere was in TCM-199 modified (control group). The water bath treatments in tubes the TCM-199 had a addition of 25 mM of N-2-hidroxyethylpiperazine-N'-2-ethanosulfonic acid (HEPES). The CCO in vitro fertilization was performed in Talp-Fert medium with 10mM a 28.7 mM of HEPES, under mineral oil in tubes kept in water bath at 39°C, during 10 to 18 hours. Zygotes were cultured 4 well dishes, in bag system, with SOFaa medium with 5,00% estrus cow serum, under mineral oil, in incubator with 5,00%CO2, 5,00%O2 and 90,00%N2, at 39°C for 9 days. The results showed that CCO can be matured for 24 hours in tubes kept in water bath and also fertilized during 10 hours in tubes with Talp-Fert medium added of 25mM HEPES. The cleavage, D7 and D9 blastocysts rates in tubes without controlled atmosphere were similar (P>0.05) to those in the incubator procedures. However, the fertilization in Talp-Fert medium added of 10mM a 28.7 mM of HEPES in tubes kept in water bath for 18 hours had a detrimental effect on the embryonic development