Flow cytometric assay optimization for peripheral blood monocyte tissue factor analysis

A citometria de fluxo permite a análise individual de células quando há expressão de moléculas de membrana, produtos citoplasmáticos e nucleares. Quando se utiliza a marcação prévia das células com anticorpos monoclonais é possível estudar constituintes de membrana característicos de uma determinada linhagem celular. Assim, esta metodologia tem sido largamente utilizada, principalmente na área de onco-hematologia e dos transplantes de medula óssea. A possibilidade de se utilizarem dois ou mais anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos diferentes permite o estudo em uma determinada população celular de substâncias pró-coagulantes produzidas por células envolvidas nos mecanismos da hemostasia, abrindo-se a possibilidade de aplicação desta metodologia em áreas de estudo da fisiopatologia relacionada aos estados de hipercoagulabilidade. Os monócitos estão altamente envolvidos nos processos fisiopatológicos envolvendo a formação de trombo e placas ateromatosas, e o Fator Tissular (FT) consiste no principal ativador fisiológico do sistema de coagulação sangüínea. Monócitos estimulados ou não por lipopolissacárides de Escherichia coli expressam FT em condições fisiológicas normais. Neste trabalho buscou-se otimizar as condições de determinação da expressão de FT em monócitos por citometria de fluxo, a partir de metodologia já descrita, em duas populações de indivíduos sadios, com faixas etárias diferentes, no sentido de se estabelecerem os níveis de expressão de FT. Para a análise dos resultados foram utilizadas duas metodologias que definem o percentual de células expressando FT. Dos resultados obtidos, pode-se concluir que não há diferença significativa na expressão de FT de monócitos em função da idade e que os dois métodos de análise utilizados não diferem entre si.The development of the flow cytometric assay using monoclonal antibodies labeled with different fluorescent substances enables the identification of a particular cell population even if it is present in heterogeneous cell samples. This technique has been applied to oncohematology and bone marrow transplantation studies. Two combined fluorescent monoclonal antibodies enable the study of a particular cell population in the expression of procoagulant substances produced by cells involved in homeostatic mechanisms. The application of this methodology creates the perspective of pathophysiologic studies related to hypercoagulability states. Considering that monocytes are highly involved in pathophysiologic mechanisms contributing to thrombus formation and atheromatous plaques and that Tissue Factor represents the principal physiologic activator of the clotting system, this study constitutes a potential tool for obtaining new insights of the role of monocytes in diseases associated to hypercoagulability states. The present work aimed to establish the optimization of conditions for measuring the tissue factor expression in monocytes stimulated or not by lipopolysaccharides from Escherichia coli and analyzed by flow cytometric assay based on a previous methodology. Blood samples were collected from healthy subjects and divided in two age ranges. Studies on monocytes were carried out comparing two methods of analysis, which define the percentage of cells expressing tissue factor on their surface. From the results, it was concluded that there is no difference between the two age ranges related to the tissue factor expression in monocytes. In addition, there were no significant differences between the two assessed methods of analysis