Analysis of p16 gene mutations and deletions in childhood acute lymphoblastic leukemias

CONTEXT: The p16 tumor suppressor gene encodes a cyclin-dependent kinase 4 inhibitor that blocks cell division during the G1 phase of the cell cycle. Alterations in this gene have been reported for various neoplasia types, including acute lymphoblastic leukemias (ALL), especially T-cell acute lymphoblastic leukemias (ALL). OBJECTIVE: To determine probable alterations in the p16 gene in children with acute lymphoblastic leukemias using the polymerase chain reaction (PCR) and direct DNA sequencing and also to analyze event-free survival (EFS). DESIGN: Retrospective study. SETTING: Department of Child Care and Pediatrics, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, Universidade Federal de São Paulo. PARTICIPANTS: Fifty-six children with ALL (mean age 4 years). Forty (71.43%) had B-cell and 12 (21.43%) had T-cell ALL; 4 (7.1%) were biphenotypic. SAMPLE: DNA samples were extracted from bone marrow upon diagnosis and/or relapse. In 2 T-cell cases, DNA from cerebrospinal fluid (CSF) was analyzed. MAIN MEASUREMENTS: Deletions or nucleotide substitutions in exons 1, 2 and 3 of the p16 gene were determined by PCR and nucleotide sequencing. Event-free survival was determined by the Kaplan-Meyer and log-rank test for patients carrying normal and altered p16. RESULTS: Deletions in exon 3 were observed in five cases. Abnormal migration in PCR was observed in seven cases for exon 1, six for exon 2, and five for exon 3. Mutations in exon 1 were confirmed by direct DNA sequencing in four cases and in exon 2 in two cases. The Kaplan-Meyer survival curves and the log-rank test showed no significant differences in 5-year EFS between children with normal or altered p16, or between patients with B-ALL carrying normal or altered p16 gene. Patients with T-ALL could not be evaluated via Kaplan-Meier due to the small number of cases. CONCLUSIONS: Our results, particularly regarding deletion frequency, agree with others suggesting that deletions in the p16 are initial events in leukemia genesis. The small number of samples did not allow stablishment of correlation between childhood ALL and the p16 point mutations found in our study. Kaplan-Meier analysis revealed no significant correlation between EFS and alterations in ALL. The p16 alterations frequency observed for B and T-ALL agreed with reports from other centers.CONTEXTO: O gene supressor tumoral p16 codifica uma proteína inibidora da quinase ciclina dependente 4(cdk4) que bloqueia a divisão celular na fase G1 do ciclo celular. Alterações neste gene foram relatadas em várias neoplasias, incluindo as leucemias linfoblásticas agudas, principalmente da linhagem T. OBJETIVO: Verificar prováveis alterações do gene p16 em leucemias linfoblásticas agudas em crianças, utilizando o método de reação de polimerase em cadeia - polimorfismo conformacional em fita simples e seqüenciamento direto de nucleotídeos e comparar a sobrevida livre de eventos com a presença ou não de alterações (deleções ou substituições de bases) do gene p16, utilizando o método de Kaplan-Meir e teste log-rank. TIPO DE ESTUDO: Estudo retrospectivo. LOCAL: Departamento de Puericultura e Pediatria da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. PARTICIPANTES: Foram estudadas 56 crianças (16 do sexo feminino e 40 do masculino) com leucemia aguda com idade média de quatro anos. Quarenta pacientes (71,43%) tinham leucemias linfoblásticas agudas de células B, 12 (21,43%) tinham leucemias linfoblásticas agudas de células T e 4 (7,1%) eram bifenotípicas. AMOSTRA: Amostras de DNA foram extraídas de medula óssea obtidas ao diagnóstico e/ou na recaída. Em dois casos de leucemias linfoblásticas agudas de células T, o DNA obtido do líquido céfalo-raquidiano foi analisado. VARIÁVEIS ESTUDADAS: Deleções ou substituições de bases nos éxones 1, 2 e 3 do gene p16 foram determinadas pela reação de polimerase em cadeia - polimorfismo conformacional em fita simples e seqüenciamento de nucleotídeos. A sobrevida livre de eventos foi determinada segundo o método de Kaplan-Meier e teste log-rank para pacientes com gene p16 normal e alterado. RESULTADOS: Em cinco casos (quatro leucemias linfoblásticas agudas pré B CALLA+ e uma leucemia linfoblástica aguda T) foram observadas deleções no éxon 3. Foram verificadas migrações anômalas no polimorfismo conformacional em fita simples em sete casos no éxon 1, seis no éxon 2 e cinco no éxon 3. A confirmação da mutação pelo seqüenciamento direto do DNA ocorreu em quatro casos no éxon 1 e 2 no éxon 2. Foram comparadas as curvas de sobrevida pelo método de Kaplan-Meier e teste log-rank e não se obteve diferença estatisticamente significativa da sobrevida livre de eventos em cinco anos entre os grupos de criança com leucemia linfoblática aguda com p16 normal e alterado e também entre os pacientes com leucemia linfoblástica aguda B com p16 normal e alterado. Não foi possível avaliar pelo método de Kaplan-Meier os pacientes com leucemia linfoblástica aguda T devido ao pequeno número de casos. CONCLUSÕES: Os resultados obtidos, principalmente em relação à freqüência de deleções, foram concordantes com vários autores que sugerem que deleções do gene p16 possam ser eventos iniciais da gênese leucêmica. Tendo em vista o pequeno número de amostras estudadas, não foi possível realizar a correlação entre leucemia linfoblática aguda na infância e as mutações de ponto no gene p16 encontradas neste estudo. Não se obteve significância estatística entre sobrevida livre de eventos e alterações do p16 em leucemia linfoblática aguda pelo método de Kaplan-Meier. A freqüência de alterações do p16 em leucemia linfoblástica aguda B e T foram concordantes com os estudos realizados em alguns centros mundiais. Sugerimos a realização de uma pesquisa multicêntrica com um maior número de casos, principalmente sobre leucemia linfoblástica aguda T, a fim que seja possível traçar um perfil de alterações do gene p16 em crianças brasileiras