Overexpression and biochemical characterization of protein dipeptidyl-peptidase III from thermophilic bacteria Caldithrix abyssi

Dipeptidil-peptidaze III (DPPIII) su egzopeptidaze koje prema MEROPS bazi podataka pripadaju obitelji metalopeptidaza M49. Kako bi se okarakterizirala porodica DPPIII i kod termofilnih organizmima, za ovaj rad odabran je član porodice DPPIII iz anaerobne, termofilne bakterije Caldithrix abyssi koja se može naći u morskim hidrotermalnim izvorima. Primijećeno je da prvi motiv aktivnog mjesta proteina CaDPPIII sadrži pentapeptidni motiv 'HEISH' umjesto karakterističnog heksapeptidnog motiva 'HEXXGH', dok je drugi motiv potpuno očuvan. Provedena je heterologna ekspresija kodirajućeg slijeda proteina DPPIII s histidinskim i glutation-S-transferaznim privjeskom. Rekombinantni protein pročišćen je afinitetnom kromatografijom i gel-filtracijom. Proteinu CaDPPIII-His6 određena je izoelektrična točka (pI = 6,12), te je nativnom gel-elektroforezom i izoelektričnim fokusiranjem pokazano postojanje dva različita strukturna oblika. Ispitivanje sintetskih supstrata peptidaza, pokazalo je značajnu hidrolitičku aktivnost enzima prema Arg-Arg-2-naftilamidu (Arg2-2NA), Gly-Arg-2NA, Phe-Arg-2NA i Pro-Arg-2NA. Ioni metala nemaju značajan utjecaj na peptidaznu aktivnost prema supstratu Gly-Arg-2NA. Najveća peptidazna aktivnost pokazana je kod pH = 7,0 i kod temperatura od 55 ˚C do 65 ˚C. Potpunu inhibiciju enzimske aktivnosti uzrokovali su kelirajući agensi, dok je djelomična inhibicija pokazana sa sulfhidrilblokirajućim reagensima. Kinetička mjerenja pokazala su da CaDPPIII kao supstrat preferira Arg2-2NA kao i drugi okarakterizirani enzimi ove porodice. U usporedbi s humanim, kvaščevim i enzimom iz Bacteroides thetaiotaomicron, Km enzima CaDPPIII je znatno veći, dok je konstanta brzine reakcije prvog reda koja odgovara pretvorbi supstrata u produkt (kcat) usporediva s istom konstantom enzima iz B. thetaiotaomicron. Dobiveni rezultati potvrđuju da je protein CaDPPIII član porodice DPPIII.Dipeptidyl-peptidases III (DPPsIII) are exopeptidases that are classified as M49 family of metallopeptidases in MEROPS database. To better understand DPPsIII from thermophilic organisms, a protein from anaerobic, thermophilic bacteria Caldithrix abyssi was chosen for this thesis. These bacteria can be found in Mid-Atlantic Ridge hydrothermal vents. Protein CaDPPIII has a modified pentapeptide 'HEISH' active site motif, instead of characteristic 'HEXXGH' while the second motif is conserved. The gene for CaDPPIII with His-tag and GST-tag was heterologously expressed. The recombinant protein was purified with affinity and size exclusion chromatography. Isoelectric point (pI =6,12) was determined and two structural forms were detected by native electrophoresis and isoelectric focusing. Among various synthetic peptidase substrates examined, CaDPPIII-His6 preferred Arg-Arg-2-naphthylamide (Arg2-2NA), Gly-Arg-2NA, Phe-Arg-2NA and Pro-Arg-2NA. No significant enhancement in peptidase activity was observed in the presence of metal ions. Its hydrolytic activity was highest at pH = 7,0, and at 55 ˚C to 65 ˚C. Chelating agents completely inhibited the enzyme, while the sulfhydryl reagents inhibited it partially. Kinetic measurements showed that preferred substrate is Arg2-2NA, a characteristic DPPIII substrate. Constant Km is substantially higher for this enzyme compared to human, yeast and bacterial enzyme. First-order rate constant (kcat) is comparable with the same constant of the bacterial enzyme. Obtained results confirm CaDPPIII as a member of DPPIII family