Caracterización Estructural y Funcional de una Metaloproteasa del Veneno de Bothrops roedingeri por Aproximación Proteómica

Las especies pertenecientes al género Bothrops son muy importantes en el campo de la investigación por poseer enzimas proteolíticas, la cual tiene como características principales tener una variada acción biológica y contribuir con desórdenes en coagulación, necrosis y formación de hemorragias por ende se necesita una plataforma moderna en el estudio de estas enzimas para así poder sugerir un modelo metodológico actualizado en el estudio de todas las proteínas expresadas por un sistema biológico que nos permita conocer el estado actual de la especie, así como utilizar esta información en la construcción biotecnológica de informaciones con posibles fines terapéuticos futuros. El primer objetivo trazado es purificar y caracterizar una de las enzimas proteolíticas presentes en el veneno de la serpiente peruana Bothrops roedingeri como es la metaloproteasa para lo cual se trabajó inicialmente mediante cromatografía de Interacción Hidrofóbica con columnas del sistema HITrap en la cual nos dio como resultado la presencia de 6 picos, siendo el pico 2 aquel que mostró actividad hemorrágica siendo denominada HFBr, con esta fracción obtenida se realizó una electroforesis SDS PAGE en condición reductora con uso de DTT que evidenció una masa molecular de 23 kDa y en condición no reductora una masa de ~27 kDa. , para la determinación de la masa intacta del veneno recurrimos al método de Espectrometría de Masas obteniendo nuestros resultados crudos e intactos por Electrospray (ESI) dando un resultado de 27342.6641 Da. Se realizó una caracterización de la estructura primaria de “novo” por hidrolisis tríptica (MALDI/TOF) obteniendo 6 secuencias de aminoácidos para posteriormente realizar un análisis Bioinformático a través de la Base de datos SWISS-PROT para luego realizar un análisis de homología secuencial con uso del Software DNAStar especificando que la proteína estudiada es una Metaloproteasa de la familia de las Hemorraginas. Finalmente se hizo pruebas para su caracterización biológica para determinar la actividad hemorrágica con un método de inoculación intradérmica en ratones obteniendo los valores de hemorragia inducida de Bothrops roedingeri correspondiendo a 9.5 mm ± 0.15 mm para el veneno total y de 8 ± 0.12 mm para la fracción HFBr, respectivamente. El procedimiento realizado como es la “Proteómica” nos sirvió para la obtención y caracterización de metaloproteasas procedentes de la especie Bothrops para un futuro fin científico, tecnológico y terapéutico. Palabras clave: HITrap, Cromatografía, SDS PAGE, Espectrometría de Masas, ESI, MALDI/TOF, Hidrolisis, Actividad hemorrágica, Proteómica.Tesi