Reidentification of bacterial strains from probiotic nutraceutical products

Na tržištu su značajno prisutni probiotički nutraceutički proizvodi, koji se primjenjuju za terapiju poremećaja gastrointestinalnog trakta (GIT) odraslih, djece i novorođenčadi. Stoga je neophodna precizna identifikacija te definiranje funkcionalnih učinaka prisutnih bakterijskih sojeva. Cilj ovog rada je reidentifikacija bakterijskih kultura iz probiotičkih nutraceutičkih proizvoda, te karakterizacija funkcionalnih svojstava važnih za iskazivanje probiotičkog djelovanja u GIT-u. Izolirani sojevi su gram-pozitivne, nesporogene i katalaza-negativne bakterije, koje uspješno rastu pri 37ºC u anaerobim uvjetima te tijekom uzgoja u selektivnim tekućim podlogama: MRS za laktobacile, TOS-propionat za bifidobakterije, a značajno snižavaju pH vrijednost podloge uslijed sinteze visokih koncentracije mliječne kiseline. Pomoću API 50 CHL testa identificirani su sojevi Lactobacillus vrste, a BBL CRYSTAL™ GP sustavom za identifikaciju sojevi Bifidobacterium vrste. Na temelju proteinskih profila dobivenih SDS-PAGE analizom ukupnih staničnih i površinskih proteína, bakterijski sojevi su svrstani izradom dendrograma pomoću Gel Compare II programskog paketa u dva roda Lactobacillus i Bifidobacterium. Ispitana je i otpornost pojedinih sojeva in vitro na uvjete GIT određivanjem preživljavanja u simuliranom želučanom soku i simuliranom soku tankog crijeva, te u prisutnosti 0,3% i 0,6% žučnih soli. Smrtnost probiotičkih sojeva nakon 6 sati je iznosila od 0,94-3,16 log (CFU/ml), što ukazuje na uspješno preživljavanje u simuliranim uvjetima GIT-a. Probiotičke bakterije su različito otporne na testirane koncentracije žučnih soli. Nakon preživljavanja nepovoljnih uvjeta u GIT-u, iskazivanju funkcionalnih učinaka probiotičkih sojeva može doprinjeti adhezija na intestinalnu sluznicu, stoga je ispitana i njihova sposobnost adhezije na mucin in vitro. Pojedini sojevi, primjerice Lactobacillus reuteri DSM 17938, iskazuju mogućnost vezanja na mucin. Na temelju dobivenih rezultata može se zaključiti da ispitane probiotičke bakterije uspješno preživljavaju nepovoljne uvjete GIT-a domaćina, što je jedan od glavnih kriterija za izbor probiotika kao bioterapeutika.Probiotic nutraceutical products, which are used in the treatment of gastrointestinal tract (GIT) disorders in adults, children and infants, are substantially present on the market. Therefore, precise identification and defining of functional effects of bacterial strains is essential. The aim of this thesis is reidentification of bacterial cultures from probiotic nutraceutical products, and characterization of functional properties important for expression of probiotic activity in the GIT. The isolated strains are gram-positive, non-sporogenous and catalase-negative bacteria, which grow successfully at 37˚C in anaerobic conditions in selective nutrient media: MRS for lactobacilli, TOS propionate for bifidobacteria, and significantly lower pH due to the synthesis of high concentrations of lactic acid. Strains of Lactobacillus species have been identified using the API 50 CHL test and strains of Bifidobacterium species using BBL CRYSTALTM GP identification system. Based on whole cell and surface protein profiles obtained by SDS-PAGE analysis, bacterial strains are classified in two genera by creating dendrograms using Gel Compare II software. In vitro resistance to GIT conditions of individual strains has also been tested by assessment of survival in simulated gastric and simulated intestinal juices and by tolerance to 0,3% and 0,6% bile salts. Mortality of probiotic strains after 6 hour incubation ranged between 0,94-3,16 log (CFU/ml), indicating successful survival in simulated GIT conditions. Probiotic bacteria are differently resistant to the tested concentrations of bile salts. Besides survival of stress conditions in GIT, adhesion to intestinal mucosa may contribute to the expression of the functional effects of probiotic strains, and thus ability of strains to adhere to mucin in vitro has also been tested. Based on the results, it can be concluded that tested probiotic bacteria successfully survive adverse conditions of the host's GIT, which is one of the main criteria for the selection of probiotics as biotherapeutics