The influence of the length of palindromic sequences on the stability of yeast Saccharomyces cerevisiae

Palindromske sekvencije posebna su vrsta obrnuto ponovljenih sekvencija kod kojih dva obrnuta ponavljanja nisu odijeljena niti jednim parom baza. Pronađene su u genomima i prokariota i eukariota gdje se nalaze u funkcionalno važnim cis djelujućim regijama kao što su promotorske i terminatorske regije te ishodišta replikacije. Međutim, brojna su istraživanja pokazala da su palindromske sekvencije, zbog svoje sposobnosti da stvaraju sekundarne strukture, izrazito rekombinogene te su tako klasificirane kao rizični motivi u DNA. Rekombinogenost palindromskih sekvencija direktno je proporcionalna njihovoj duljini, međutim minimalna duljina palindromskih sekvencija koja stimulira rekombinaciju u mitotskim stanicama kvasca S. cerevisiae još nije precizno utvrđena. Stoga je sa tim ciljem u prethodnim istraživanjima provedenim u ovom laboratoriju razvijen eksperimentalni sustav kojim je moguće pratiti utjecaj duljine i položaja palindromskih sekvencija na stabilnost genoma kvasca S. cerevisiae, a koji se temelji na intrakromosomskoj “pop-out” rekombinaciji između dviju ponovljenih regija CYC1. Pokazano je da palindromske sekvencije duge 110 bp znatno stimuliraju, dok one kraće od 40 bp ne stimuliraju rekombinaciju te da jakost stimulacije ovisi o položaju palindromske sekvencije. Kako bi se dobili precizniji podaci o minimalnoj duljini palindroma koja stimulira rekombinaciju, u ovom su radu konstruirana četiri nova soja kvasca te je primjenjena reproducibilnija metoda određivanja stope “pop-out” rekombinacije temeljena na fluktuacijskoj analizi. Utvrđeno je da se duljina palindromskih sekvencija koja još ne inducira “pop-out” rekombinaciju nalazi između 50 i 78 pb te da je stimulacija “pop-out” rekombinacije dva do tri puta veća ako se palindromska sekvencija nalazi između dviju ponovljenih regija CYC1 nego kada se palindromska sekvencija približno iste duljine nalazi u lijevoj kopiji regije CYC1.Palindromic sequences are a special category of repeated sequences that consist of two identical inverted repeats with no spacer regions. They have been found to occur in both prokaryotic and eukaryotic genomes in functionally important cis acting regions such are promoters, terminators and origins of replication. However, it has been shown that, due to their ability to form secondary structures, they also stimulate recombination and have therefore been classified as at-risk DNA motifs. Although the stimulation of recombination increases with length, the exact minimal size of palindrome required to stimulate recombination in yeast S. cerevisiae is not yet known. In order to determine that minimal size, in previous studies an experimental model that enables monitoring of influence of length and position of the palindromes on the rate of pop-out recombination and is based on intrachromosomal recombination between two direct CYC1 repeats was developed. It has been shown that 110 bp long palindromes greatly induce while palindromes shorter than 40 bp do not induce recombination. It was also shown that the position of the palindromes has an important influence on induction of recombination. In order to get a more precise data, we have constructed four new yeast strains and used a more precise method for calculating pop-out recombination rate based on fluctuation analysis. It is shown that the minimal length of palindromic sequences that doesn’t stimulate pop-out recombination is between 50 and 78 bp and that stimulation of recombination is two to three times stronger in strains with palindromic sequence positioned between two CYC1 repeats than in strains with palindromes of approximately the same length positioned in the left copy of CYC1 gene