Glycosylation and Glycodiversification in Polyketide Antibiotics: Unraveling Biosynthetic Steps in Nogalamycin Formation

Soil-dwelling Streptomyces bacteria are known for their ability to produce biologically active compounds such as antimicrobial, immunosuppressant, antifungal and anticancer drugs. S. nogalater is the producer of nogalamycin, a potential anticancer drug exhibiting high cytotoxicity and activity against human topoisomerases I and II. Nogalamycin is an anthracycline polyketide comprising a four-ring aromatic backbone,a neutral deoxy sugar at C7, and an amino sugar attached via an O–C bond at C1 and a C–C bond between C2 and C5´´. This kind of attachment of the amino sugar is unusual thus making the structure of the compound highly interesting. The sugar is also associated with the biological activity of nogalamycin, as it facilitates binding to DNA. Furthermore, the sugar moieties of anthracyclines are often crucial for their biological activity. Together the interesting attachment of the amino sugar and the general reliance of polyketides on the sugar moieties for bioactivity have made the study of the biosynthesis of nogalamycin attractive. The sugar moieties are typically attached by glycosyltransferases, which use two substrates: the donor and the acceptor. The literature review of the thesis is focused on the glycosylation of polyketides and the possibilities to alter their glycosylation patterns. My own thesis work revolves around the biosynthesis of nogalamycin. We have elucidated the individual steps that lead to its rather unique structure. We reconstructed the whole biosynthetic pathway in the heterologous host S. albus using a cosmid and a plasmid. In the process, we were able to isolate new compounds when the cosmid, which contains the majority of the nogalamycin gene cluster, was expressed alone in the heterologous host. The new compounds included true intermediates of the pathway as well as metabolites, which were most likely altered by the endogenous enzymes of the host. The biological activity of the most interesting new products was tested against human topoisomerases I and II, and they were found to exhibit such activities. The heterologous expression system facilitated the generation of mutants with inactivated biosynthetic genes. In that process, we were able to identify the functions of the glycosyltransferases SnogE and SnogD, solve the structure of SnogD, discover a novel C1-hydroxylase system comprising SnoaW and SnoaL2, and establish that the two homologous non-heme α-ketoglutarate and Fe2+ dependent enzymes SnoK and SnoN catalyze atypical reactions on the pathway. We demonstrated that SnoK was responsible for the formation of the additional C–C bond, whereas SnoN is an epimerase. A combination of in vivo and in vitro techniques was utilized to unravel the details of these enzymes. Protein crystallography gave us an important means to understand the mechanisms. Furthermore, the solved structures serve as platforms for future rational design of the enzymes.Maaperässä esiintyvät Streptomyces-suvun bakteerit tunnetaan niiden kyvystä tuottaa biologisesti aktiivisia yhdisteitä. Nogalamysiini on potentiaalinen syöpälääke, joka on solumyrkyllinen ja aktiivinen ihmisen topoisomeraasi I:tä ja II:ta vastaan. S. nogalater -kanta tuottaa sitä. Nogalamysiini on antrasykliinipolyketidi, joka koostuu nelirenkaisesta aromaattisesta rungosta ja siihen C7-asemaan liittyneestä neutraalista sokerista sekä aminosokerista, joka on liittynyt sekä O–C-sidoksella asemaan C1 että C–C-sidoksella C2- ja C5´´-aseman välillä. Yhdisteen rakenne on hyvin mielenkiintoinen, sillä aminosokeri on kiinnittynyt hyvin epätyypillisellä tavalla ja on omalta osaltaan vastuussa nogalamysiinin biologisesta aktiivisuudesta, sillä se auttaa molekyylin sitoutumisessa DNA:han. Myös yleisellä tasolla sokeriosat ovat usein vastuussa polyketidien biologisesta aktiivisuudesta. Yhdessä rakenteen epätavallisuus sekä sokeriosien tärkeys ovat tehneet nogalamysiinin tutkimisesta olennaista. Sokeriosien kiinnittämisestä vastaa tyypillisesti sokerinsiirtäjäentsyymi glykosyylitransferaasi. Tämä entsyymi käyttää substraatteinaan kahta molekyyliä, aktivoitua sokeria ja vastaanottajamolekyyliä, johon sokeri liitetään. Työni kirjallisuuskatsaus keskittyy sokerien liittämiseen polyketideihin sekä mahdollisuuksiin muuttaa näitä sokerointimalleja. Omat tutkimustulokseni liittyvät nogalamysiinin biosynteesiin, jonka yksittäisiä askeleita olemme tutkineet selvittääksemme, mistä yhdisteen lähes ainutlaatuinen rakenne johtuu. Siirsimme nogalamysiinin biosynteesistä vastaavan geeniklusterin heterologiseen isäntään, S. albukseen, kosmidin ja plasmidin avulla. Kun siirsimme isäntäkantaan ainoastaan kosmidin, joka sisälsi suurimman osan klusterista, mutta ei kaikkia geenejä, havaitsimme kannan tuottavan uusia yhdisteitä. Työssä mittasimme uusien yhdisteiden bioaktiivisuuden ihmisen topoisomeraaseja I:tä ja II:ta vastaan, ja niissä huomattiin olevan aktiivisuutta. Biosynteesiin liittyvien geenien ilmentäminen heterologisessa isännässä mahdollisti inaktivointimutanttien teon. Työn aikana pystyimme selvittämään kahden sokerinsiirtäjäentsyymin, SnogE:n ja SnogD:n, toimintaa sekä SnogD:n rakenteen. Lisäksi löysimme uudenlaisen C1-aseman hydroksylaatiosysteemin, joka koostuu SnoaW:stä ja SnoaL2:sta, sekä kaksi homologista hemitöntä α-ketoglutaraatti- ja rauta2+ -riippuvaista entsyymiä: SnoK:n ja SnoN:n. Osoitimme, että SnoK on vastuussa epätyypillisen hiili–hiilisidoksen muodostumisesta, kun taas SnoN on epimeraasi. Entsyymien toiminnan yksityiskohtien selvittämiseksi käytimme sekä in vivo- että in vitro -tekniikoita. Proteiinikristallografian avulla selvitimme kolmen entsyymin kolmiulotteiset rakenteet, joiden avulla pystyimme ymmärtämään entsyymien reaktiomekanismeja paremmin. Lisäksi rakenteet helpottavat proteiinien muokkausta.Siirretty Doriast