Compréhension des mécanismes d'action des molécules antimicrobiennes utilisant nanobiotechnologies

My PhD work consists in using Atomic Force Microscopy (AFM) techniques to study pathogenic microorganisms, and to probe their interactions with antimicrobials. During the last three decades, microbial resistance has dramatically increased and spread around the world. Pathogenic bacteria and yeasts have developed several ways to resist against almost all antimicrobials used. These pathogens can cause a wide range of superficial infections, but are also the cause of life-threatening infections in some patients. There are therefore two emergencies; the first one is to find new antimicrobial molecules, with an innovative mechanism of action. To reach this goal, it is mandatory to get further fundamental knowledge on the microbial cell wall, in order to identify original targets at the cell surface for new molecules. Therefore the second emergency is to develop techniques to explore microbial surfaces from a different angle, which requires an original experimental approach. In this context, biophysical approaches still remain underexploited in clinical microbiology. In my PhD, we took advantage of a technology coming from physics, and adapted to biological conditions, AFM. Its principle relies on the measure of a force between a sharp tip and a surface; by keeping this force constant while scanning the sample, it is possible to get a three dimensional image of it. An advantage of AFM is the possibility to work in liquid on living cells, which allowed us to image the elongation of live bacterial cells of P. aeruginosa treated by ticarcillin, a cell wall targeting antibiotic, and the removal of capsular polysaccharides from K. pneumoniae upon treatment with colistin, a last chance antibiotic. Nevertheless, sample immobilization is often a challenge that must be addressed for each kind of microorganisms studied. It represents an entire field of research, and led us to engineer a microstructured polydimethylsiloxane (PDMS) stamp to immobilize round cells of different sizes such as yeasts. Once this step was accomplished, AFM can be used in classic imaging and force spectroscopy modes (contact mode, oscillating mode, force volume mode), but also in advanced modes in order to acquire multiparametric sets of data on living cells. Indeed, AFM is also a highly sensitive force machine, able to record force distance curves that give access to nanomechanical and adhesive properties of living cells. We therefore used the multiparametric imaging mode, QITM from JPK Instruments, to image and quantify the nanomechanical/adhesive properties of microorganisms as well as mammalian cells and their isolated nucleus. We could then observe the modifications of the adhesive properties of the yeast C. albicans, treated or not by caspofungin, a last chance antifungal. Finally, to get further in the architecture of the cell wall of microorganisms, it is possible to functionalize AFM tips with biomolecules. A strategy that we have developed has consisted of grafting antibodies targeted against a peptide on the AFM tip while tagging proteins with the same peptide at the surface of living cells. This allowed mapping the localization of specific proteins at the surface of living yeasts and mammalian cells. Another strategy we developed has consisted in directly grafting on the AFM tip a biomolecule that naturally interacts with cell wall components. We used this last strategy to probe the bacterial cell wall of P. aeruginosa submitted to treatment by an innovative antibacterial, Cx1, and better understand the structure of its peptidoglycan. In conclusion, during my PhD, we especially addressed the contribution of biophysics in clinical microbiology. We developed original techniques to immobilize samples, to functionalize AFM tips, and used advanced multiparametric AFM modes to acquire original data on the surface of pathogenic microorganisms, in native conditions or in interaction with antimicrobials.Mon travail de thèse consiste à utiliser les techniques de Microscopie à Force Atomique (AFM) pour étudier les microorganisms pathogènes, et leurs interactions avec des antimicrobiens. Ces dernières décennies, la résistance microbienne a augmenté de façon dramatique et s’est répandue dans le monde. Les bactéries et levures pathogènes ont développé différents moyens pour résister à presque tous les antimicrobiens utilisés. Ces pathogènes peuvent être la cause d’une large gamme d’infections superficielles ; ils sont aussi à l’origine d’infections mettant en jeu la vie de patients. Il y a donc deux urgences : la première est de trouver de nouvelles molécules antimicrobiennes, avec un mécanisme d’action innovant. Mais pour atteindre cet objectif, il est nécessaire d’acquérir des données fondamentales sur la paroi des microorganismes, afin d’identifier des cibles originales à leur surface pour de nouvelles molécules. La deuxième urgence est donc de développer des techniques pour explorer la paroi des microorganismes d’un point de vue différent, ce qui nécessite une approche expérimentale originale. Dans ce contexte, les approches biophysiques restent sous-exploitées en microbiologie clinique. Durant cette thèse, nous avons utilisé une technologie provenant de la physique, l’AFM, adapté aux conditions biologiques. Le principe de l’AFM est basé sur la mesure d’une force entre une pointe et un échantillon ; en gardant cette force constante pendant le scan de l’échantillon il est possible d’en obtenir une image tridimensionnelle. Un avantage de l’AFM est la possibilité de travailler en liquide, ce qui nous a permis d’imager l’élongation de cellules bactériennes P. aeruginosa traité avec de la ticarcilline, un antibiotique à cible pariétale, ainsi que la disparition des polysaccharides capsulaires de la bactérie K. pneumoniae traitée avec de la colistine. Cependant, l’immobilisation des échantillons est souvent un challenge, différent pour chaque type de microorganismes. L’immobilisation d’échantillons biologiques représente un domaine de recherche à part entière, qui nous a conduit à développer un timbre de polydiméthylsiloxane (PDMS) microstructuré, pour immobiliser des cellules rondes de différentes tailles, comme des levures. Une fois cette étape d’immobilisation franchie, l’AFM peut être utilisé dans les modes classiques d’imagerie et de spectroscopie de force (mode contact, mode oscillant, mode force volume), mais aussi dans des modes avancés afin d’obtenir des données à haute résolution ou multiparamétriques. En effet, l’AFM est aussi une machine de force très sensible capable d’enregistrer des courbes de force qui permettent d’accéder aux propriétés nanomécaniques et d’adhésion des cellules. Ainsi nous avons pu imager et quantifier les propriétés nanomécaniques et adhésives de microorganisms, mais aussi de cellules de mammifères vivantes et de leurs noyaux isolés. Nous avons ainsi observé les modifications des propriétés adhésives de la levure C. albicans traité avec de la caspofongine. Enfin pour aller plus loin dans l’étude de l’architecture des parois des microorganismes, il est possible de fonctionnaliser des pointes AFM avec des biomolécules. Une stratégie développée a consisté à lier des anticorps dirigés contre un peptide sur la pointe, et de tagguer des protéines avec ce même peptide à la surface des cellules, Ainsi nous avons localisé des protéines spécifiques à la surface de levures et cellules de mammifères vivantes. Une autre stratégie développée consiste à directement lier une biomolécule sur la pointe, qui interagit naturellement avec un composé pariétal. Nous avons utilisé cette stratégie pour étudier la paroi de la bactérie P. aeruginosa traité par un antibactérien innovant, le Cx1, et ainsi mieux comprendre l’architecture de son peptidoglycane. Pour conclure, cette thèse a permis d’adresser spécifiquement la contribution de la biophysique en microbiologie clinique