Učinak naltreksona na aktivacijsko stanje BV-2 mikroglija stanica

Cilj istraživanja Polazeći od hipoteze da je aktivirajuće polarizacijsko stanje (M1/M2) mikroglija stanica odgovorno za ishod bolesti središnjeg živčanog sustava (SŽS) koji u svojoj patofiziološkoj osnovi imaju upalnu komponentu, cilj ovog rada bio je istražiti potencijalno modulatorno djelovanje opioidnog antagonista naltreksona na mikrogliju u in vitro uvjetima. Specifični cilj rada bio je ispitati protuupalne učinke niskih doza naltreksona na promjenu imuno-metaboličkog profila BV-2 stanične linije mikroglije i njihovo prevođenje iz aktiviranog u mirujući imuno(neuro)protektivni fenotip. Materijali i metode Istraživanje je provedeno u in vitro uvjetima na modelu imortaliziranih BV-2 mikroglija stanica kultiviranih u standardnim uvjetima DMEM medija uz dodatak 10% FCS-a i bez dodatka FCS-a čime je postignut odgovarajući stanični fenotip kao polazište za testiranje lijeka. Promjene u morfologiji BV-2 mikroglija stanica praćene su pomoću svjetlosnog mikroskopa, a proteinski izražaj biljega M1 (iNOS) i M2 (CD206) aktivacijskog stanja metodom imunofluorescencije na staklu. Protočnom citometrijom praćen je površinski izražaj imunoloških molekula CD86, CD16/32, CD206, MHC I/II). Metaboličke promjene u stanici procjenjene su na temelju mjerenja glikolitičke aktivnosti i potrošnje kisika Seahorse metodom. Rezultati Nakon standardnog uzgoja BV-2 mikroglija stanica u DMEM mediju uz dodatak 10% FCS-a (BV-210%FCS) zapažen je pretežito ameboidan oblik. Oduzimanjem FCS-a iz medija za uzgoj, BV-2 (BV-2øFCS) stanice počinju pružati izdanke poprimajući razgranatu morfologiju koja predstavlja obilježje mirujućih mikroglija stanica. U navedenim uvjetima visoki izražaj iNOS-a obilježje je aktiviranih ameboidnih BV-210%FCS stanica dok izražaj istog opada u razgranatim mirujućim BV-2øFCS stanicama uz upravo obrnuti obrazac izražaja molekule CD206 na temelju čega je iNOSpoz CD206neg aktivirajući stanični fenotip M1 profila združen sa BV-210%FCS, a iNOSnegCD206poz mirujući stanični fenotip M2 profila sa BV-2øFCS. Pretpostavljeno protuupalno svojstvo naltreksona testirali smo na prethodno inducirajućem aktiviranom fenotipu BV-210%FCS (iNOSpoz CD206neg) primjenjujući niske koncentracije u rasponu 10-50-100-250 μM naltreksona. Koncentracija 100 μM naltreksona pokazala se najučinkovitija u postizanju mirujućeg staničnog fenotipa (iNOSneg CD206poz). Istovremeno, izražaj površinskih imunoloških molekula CD86, CD16/32 nije se značajnije mijenjao što upućuje na slabo imunomodulacijsko svojstvo naltreksona spregnuto sa zbivanjima na staničnoj površini. Polazeći od koncepta prema kojem se M1/M2 polarizacijski profil veže uz energetski i metabolički status stanice, metaboličke promjene u stanici primjenom naltreksona pratili smo Seahorse metodom mjereći glikolitičku aktivnost i potrošnju kisika. Rezultati potvrđuju da su BV-210%FCS stanice metabolički aktivne dok su BV-2øFCS mirujuće i energetski neaktivne. Koristeći FCS, LPS i IFN-ƴ kao induktore metaboličnog reprogramiranja, koji stanicu aktiviraju konfigurirajući je u odgovarajući metabolički fenotip, potvrdili smo LPS kao induktora aerobnog metabolizma, a IFN-ƴ kao čimbenika porasta anaerobnog metabolizma. Naltrekson Irena Grahovac / Učinak naltreksona na aktivacijsko stanje BV-2 mikroglija stanica je smanjio energetsku aktivnost stanice inducirane LPS-om te izrazito smanjio anaerobni metabolizam u stanicama aktiviranih s IFN-ƴ čime se naltrekson dodatno potvrđuje kao lijek koji djeluje na uspostavi ravnoteže staničnog metabolizma vodeći hiperaktivirane stanice u hipoenergetsko stanje. Zaključci Naltrekson u koncentraciji od 100 μM dovodi do pretvorbe staničnog fenotipa BV-2 mikroglija stanica iz aktiviranog (iNOSpoz CD206neg) u mirujući (iNOSneg CD206poz) fenotip. Naltrekson ne pokazuje imunomodulacijski učinak na aktivirane BV-2 mikroglija stanice budući da ne mijenja izražaj površinskih staničnih molekula (CD86, CD16/32, CD206, MHC molekula I i II razreda). Naltrekson uspostavlja ravnotežu staničnog metabolizma dovodeći BV-2 mikroglija stanice iz hiperaktiviranog (inducirane s FCS, LPS, IFN-ƴ) u hipoenergetsko stanje.Objectives Based on the hypothesis that the activating polarization state (M1 / M2) of microglia is responsible for the outcome of the CNS diseases with an inflammatory component in the pathophysiological mechanism, we joined the concept of study the ‘old’ drugs confirmed within other indication to be elucidated as the modulators of microglial cells with an ability to convert them into immune (neuro) protective phenotype. The specific aim of the work was to test the anti-inflammatory properties of low doses naltrexone to alter the immuno-metabolic profile of BV-2 microglia and their transition from activated into a resting state. Materials and methods The study was performed in in vitro conditions on the model of immortalized BV-2 microglia cells cultured in the standard DMEM media without or supplemented with 10% FCS to achieve the appropriate cell phenotype as an initial state for further experiments. Changes in morphology of BV-2 microglia cells were followed by the light microscopy and the protein expression of M1 (iNOS) and M2 (CD206) activation status by the immunofluorescence. The surface expression of immunological molecules (CD86, CD16 / 32, CD206, MHC I / II) was analyzed by flow cytometry. Metabolic cell changes were evaluated by measuring the glycolytic activity and oxygen consumption by the Seahorse method. Results After standard cultivation of BV-2 microglial cells in the DMEM medium supplemented with 10% FCS (BV-210%FCS), the predominantly amoeboic form was observed. By subtracting FCS from the growing medium, BV-2 (BV-2øFCS) cells started with branching showing a ramified morphology as a feature of the quiescent microglia. In these conditions, an increased expression of iNOS was observed in activated amoeboid BV-210%FCS cells, while a decreased expression was a feature of the ramified quiescent BV-2øFCS cells with exactly the reverse expression pattern was shown in CD206 molecule expression so based on that iNOSposCD206neg M1 activated cell phenotype was associated with BV-210%FCS and iNOSnegCD206pos M2 quiescent cell phenotype was associated with BV-2øFCS. Anti-inflammatory properties of naltrexone were tested on previously activated BV- 210%FCS(iNOSpos CD206neg) phenotype by administrating the low effective doses of naltrexone in the concentration range of 10-50-100-250 μM. Naltrexone in a dose of 100 μM was the most effective inducing a resting cell phenotype (iNOSneg CD206pos). At the same time, the expression of surface immune molecules CD86, CD16/32 did not change significantly, suggesting a weak immunomodulatory property of naltrexone coupled to the effects on the cell surface. Within the concept that M1/M2 cell profile is related to its energy and metabolic status, cell metabolic changes upon a naltrexone administration were monitored with Seahorse by Irena Grahovac / Učinak naltreksona na aktivacijsko stanje BV-2 mikroglija stanica measuring glycolytic activity and oxygen consumption rate. The results confirm that the BV- 210%FCS cells are metabolic active while the BV-2øFCS are quiescent and energetically inactive. By using FCS, LPS and IFN-ƴ as a metabolic activators with the ability to configure cell in a corresponding metabolic phenotype, LPS has been confirmed as an aerobic inducer and IFNƴ as an anaerobic metabolic inducer. Naltrexone reduced LPS-induced energetic activity and significantly reduced anaerobic metabolism in IFN-γ-activated cells and thus naltrexone can be consider as a cell metabolic modifier to preserve a balance between hyper- and hypoenergetic states. Conclusion Naltrexone administration at 100 μM concentration transformed the BV-2 microglial cell phenotype from the activated (iNOSpos CD206neg) into a resting (iNOSneg CD206pos) phenotype. Naltrexone does not immunomodulate the immune profile of BV-2 microglia cells without effecting the expression of cell surface immune molecules (CD86, CD16/32, CD206, MHC molecules I and II). Naltrexone establishes the metabolic balance of BV-2 microglia cells shifted them from hyperactivated (induced by FCS, LPS, IFN-ƴ) into hypoenergetic state