Mikrobiota spontano fermentiranih kobasica od mesa divljači

In the present study, the microbiota of three wild boar (WB1, WB2, WB3) and three deer meat (DS1, DS2, DS3) sausage types was characterised, with focus on lactic acid bacteria. The sausage samples were collected in triplicates (n=105) from each of the sausage producers at day zero (0), after 4, 7, 10, 20 days and at the end of the ripening period (20 or 40 days). Dominant LAB isolates collected from sausages were identified as Le. mesenteroides (n=259), Lb. sakei (n=190) and E. casseliflavus (n=106). However, high throughput amplicon sequencing revealed lactobacilli, mainly Lb. sakei and Lb. curvatus, as the predominant species, with 20.55 % of sequences at the beginning of fermentation and 70.48 % in mature sausages. It seems that the isolation of LAB on selective media favored the growth of Le. mesenteroides, since its predominance was also observed in the denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis of bulk colonies collected from De Man, Rogosa and Sharpe agar (MRS) plates, indicating insufficient selectivity of the used media. On the other hand, HTS can also be biased due to DNA isolation (cell lysis) and polymerase chain reaction (PCR) analysis, which can favour certain microbial population. Regarding bacterial diversity during sausage production, the number of operational taxonomic units (OTUs) was highest at day 0 and day 4, followed by a decrease toward the later phases of fermentation and ripening, which might be explained by the decrease of pH and available water for microbial growth (aw). Measured alpha diversity parameters (Shannon's index and Pielou evenness) were significantly higher in wild boar meat sausages compared to deer meat at day 4 (p<0.01) and day 7 (p<0.05), which might be linked to a different lifestyles, type of diet and feeding habits of wild boar and deer. With fermentation time, the abundance of undesired and potentially harmful microbiota decreased indicating the microbial stability and safety of final products. However, 33 % of ready-to-eat sausages can be considered as inappropriate for human consumption, due to the elevated cell counts of Enterobacteriaceae (DS2, WB3) as well as E. coli, coliforms and presumptive B. cereus (WB3). To select strains suitable to be used as indigenous starter cultures, 1326 LAB isolates were collected from sausages. Isolates were grouped based on their rep-PCR patterns, and 57 representatives were selected and screened for safety issues and technological potential, as well as probiotic potential. Around half of the tested representatives (56.14 %) was safe for application in food, of which 53.12 % showed good acidification activity (pH<4) and variable other technological traits. Based on the results of safety and technological characterization, 2 Lb. sakei strains (MRS_296 and C_7d_13) were selected and applied simultaneously in meat batter as indigenous starter cultures. Although respective strains were originally grouped in the same cluster, they exhibited different technological traits. The majority (86.49 %) of isolates recovered from inoculated batch had rep-PCR patterns that corresponded to the patterns of respective starter cultures, suggesting that applied strains were able to establish themselves from day zero and prevailed through the production. However, considering that rep-PCR patterns of MRS_296 and C_7d_13 were not possible to differentiate, it is not possible to say whether both strains survived, or only a single one, and if, which one. It seems that the inoculation of native starter cultures suppressed the growth of Enterobacteriaceae, coliforms and L. monocyogenes. The pH values were significantly lower throughout the production in the inoculated batch (p<0.05) than in control. The tyramine content was 67.18 % lower in the ready-to-eat inoculated batch compared to the control. Such results suggest the efficiency of applied starter cultures as well as highlighting their potential of its use in future.Trajne, spontano fermentirane kobasice od mesa divljači se proizvode na malim obiteljskim gospodarstvima, prateći tradicionalne recepture i postupke. Zbog toga su prepoznate i cijenjene kao autohtoni, odnosno, tradicionalni proizvodi specifičnih senzornih osobina. Međutim, budući da se proizvode bez upotrebe starter kultura i to često u varijabilnim uvjetima, fermentacija ovisi o metaboličkoj aktivnosti prirodno prisutnih populacija bakterija mliječne kiseline (BMK) te stoga mikrobiološka sigurnost krajnjeg proizvoda može biti kompromitirana. Također, na mikrobiološku (zdravstvenu) sigurnost gotovih kobasica od mesa divljači utječu mnogi faktori povezani s načinom odstrijela divljači i daljnje obrade mesa. Da bi se osigurala potrebna kvaliteta gotovih proizvoda, potrebno je u potpunosti kontrolirati čitav proizvodni proces, a jedan od načina je upotreba detaljno karakteriziranih starter kultura u njihovoj proizvodnji. Budući da komercijalne starter kulture nisu jednako efikasne u svim tipovima proizvoda, tendencija je aplikacija autohtonih startera, a upravo spontano fermentirani proizvodi koji nisu termički obrađeni predstavljaju izvor velikog broja različitih bakterijskih sojeva, naročito BMK. Dok je mikrobiota mnogih drugih tradicionalnih fermentiranih proizvoda detaljno istražena i karakterizirana, dostupna literatura o takvim saznanjima o kobasicama od mesa divljači je vrlo limitirana. Stoga je prvi korak ovog istraživanja bio karakterizirati prirodno prisutnu mikrobiotu ovakvih kobasica, te nakon toga prikupiti i detaljno karakterizirati sojeve BMK s ciljem selekcije onih bakterijskih sojeva prikladnih za daljnje korištenje kao starter kultura. Mikrobna raznolikost tri tipa kobasica od mesa divlje svinja (WB1, WB2, WB3) i tri od mesa jelena (DS1, DS2, DS3) je istražena koristeći metode ovisne i neovisne o uzgoju. Uzorci kobasica su prikupljeni u triplikatima tijekom različitih faza proizvodnje (n=105). Izdvajanjem BMK na selektivnim mikrobiološkim medijima tijekom različitih faza zrenja I fermentacije (0, 4, 7, 10, 20 ili/i 40 dana) te molekularno-biološkom identifikacijom prikupljenih izolata, Leuconostoc mesenteroides je prepoznat kao dominanta vrsta BMK (28,24 %), a sljedili su ga Lactobacillus sakei (20,72 %) i Enterococcus casseliflavus (11,55 %). Le. mesenteroides je izoliran i identificiran u velikoj mjeri na LamVab (52,31 %) i De Man, Rogosa i Sharpe agaru (MRS) (40,89 %) mikrobiološkim podlogama, od kojih se naročito LamVab smatra selektivnima za laktobacile, što upućuje na zaključak da su navedeni mediji favorizirali rast leukonostoka. Ovaj zaključak podupiru rezultati analize DNA u denaturirajućem gradijentnom gelu poliakrilamida (DGGE) konzorcija prikupljenih sa MRS medija, budući da su potvrdili dominaciju Le. mesenteroides na ovom mediju. Osim za izdvajanje i prikupljanje BMK, različiti selektivni mediji su korišteni za detekciju i određivanje vijabilnog broja (cfu/g) ostalih ciljanih mikrobnih skupina, uključujući mikrobiotu kvarenja i potecijalne patogene. Ovakav je pristup omogućio procjenu mikrobiološke ispravnosti gotovih kobasica, budući da su propisani referentni intervali temeljeni na uzgoju i određivanju broja naraslih kolonija. Utvrđeno je da ukupno 33,33 % kobasica predstavljaju rizik za konzumaciju zbog povećanog broja bakterija porodice Enterobacteriaceae (DS2, WB3), kao i E. coli, koliformnih bakterija i hemolitičkih bakterija iz grupe B. cereus (WB3). S druge strane, analizom podataka dobivenih sekvenciranjem sljedeće generacije (engl. next generation sequencing; NGS) koristeći Miseq platformu (Illumina), dobivena je šira slika o zastupljenosti različitih mikobnih zajednica, budući da je izdvojena i analizirana ukupna bakterijska DNA prisutna u kobasicama, dakle, analiza nije ograničena samo na ciljane mikrobne skupine. Općenito, najveća mikrobna raznolikost je zabilježena u samom početku proizvodnje kobasica (0. i 4. dan) nakon čega opada prema kasnijim fazama fermentacije i zrenja. Zabilježeni pad raznolikosti se može objasniti kao rezultat pada pH vrijednosti, smanjenja dostupne vode za rast bakterija (aw) i antagonizmom prirodno prisutnih BMK. Iako je općenito raznolikost ostala ujednačena kod oba tipa kobasica kada su uspoređeni isti vremenski intervali, Shannonov index i ujednačenost po Pielou su ukazali na veću razinu raznolikosti bakterijskih populacija u 4. i 7. danu kod kobasica od mesa divlje svinje (WB) nego kod kobasica od mesa jelena (DS), što je vjerojatno povezano s različitim načinom života i prehrane ovih životinja. Zajedno s trendom pada ukupne bakterijske raznolikosti tijekom fermentacije i zrenja, zabilježen je i pad neželjenih mikroorganizama, s iznimkom bakterija iz roda Stenotrophomonas i Pseudomonas čiji pad nije zabilježen. Ova je metodologija također omogućila detaljniji uvid u strukturu prisutnih zajednica BMK, pri čemu su primijećena neslaganja s rezultatima dobivenima klasičnim metodama (ovisnima o uzgoju). Analizom NGS podataka vrste roda Lactobacillus su identificirane kao dominantne, i to vrste Lb. sakei (40,32 %), Lb. curvatus (40,29 %) i Lb. plantarum (1,31 %), dok su ostale BMK detektirane u malom broju. Iako se sekvenciranje sljedeće generacije pokazalo kao pouzdan pristup za in situ karakterizaciju mikrobiote prisutne u trajnim kobasicama od divljači, izolacija i prikupljanje BMK na selektivnim podlogama je nužna za prikupljanje kolekcije vijabilnih sojeva. U ovom istraživanju je prikupljeno ukupno 917 izolata na mikrobiološkim medijima selektivnima za BMK. Međutim, BMK su također prikupljene i iz drugih trajnih tradicionalnih kobasica od mesa divlje svinje i jelena te su uključene u ovo istraživanje, tako da je ukupno prikupljeno 1326 izolata. Svi izolati su identificirani koristeći molekularno-biološke metode (rod i vrsta specifični PCR, sekvenciranje po Sangeru) te su genotipizirani pomoću rep-PCR metode koristeći GTG5 početnicu. Obrasci dobiveni repPCR metodom su pokazali visoku razlučivost između sojeva i omogućili njihovo grupiranje. Izabrano je 57 reprezentativnih sojeva koji su uključeni u daljnje analize s ciljem selekcije odgovarajućih starter kultura. Prvenstveno, istražena je sigurnost njihove upotrebe u hrani (rezistencija na antibiotike, prisutstvo gena koji kodiraju za biogene amine i virulente faktore, hemolitička aktivnost) te su istražene njihove tehnološke karakteristike (sposobnost brze acidifikacije, lipolitička, proteolitička i peptidazna aktivnost) kao i antimikrobna aktivnost. Među reprezentativnim predstavnicima, izabrano je 19 bakterijskih sojeva za koje je istražena sposobnost preživljavanja u simuliranim uvjetima gastrointestinalnog (GI) trakta. Rezultati su pokazali da je približno polovica reprezentativnih predstavnika (56,14 %) sigurna za primjenu u hrani, od kojih je 53,12 % pokazalo dobru sposobnost acidifikacije, odnosno, snizili su pH mesnog medija s početnih pH=5.8 na pH< 4 nakon 24 sata inkubacije. Velika većina reprezentativnih predstavnika koji su smatrani sigurnima je pokazala lipoličku (96.87 %) i proteolitičku aktivnost na mediju s obranim mlijekom (93.75 %), međutim samo je njih 9.37 % pokazalo sposobnost razgradnje sarkoplazmatskih proteina. Njihova je peptidazna aktivnost varirala između 203.50±0.00 i 5942.20±0.14 µM pNA. Iako je većina reprezentativnih predstavnika (n=57) u vijabilnom obliku pokazala antagonističku (antimikrobnu) aktivnost prema testiranim indikatorskim bakterijama, kada je testiranje provedeno korištenjem njihovih neutraliziranih supernatanata (slobodnih od bakterijskih stanica), antimikrobna aktivnost je zabilježena za 4 soja i to prema Listeria innocua ATCC 33090. Ovakav rezultat indicira da spomenuti sojevi mogu imati sposobnost produkcije bakteriocina. Jedan je soj (E. durans A_4d_1) pokazao sposobnost preživljavanja u simuliranih uvjetima GI trakta, naročito u uvjetima tankog crijeva koji su bili pogubni za ostale sojeve, zbog čega se može smatrati potencijalnim probiotičkim sojem. Temeljem rezultata sigurnosne i tehnološke karakterizacije, 2 soja Lb. sakei (MRS_296 and C_7d_13) su odabrana za primjenu u kobasicama kao starter kulture. Ovi sojevi se smatraju sigurnima za primjenu u hrani, budući da nisu bili hemolitički aktivni, nisu pokazali rezistenciju prema testiranim antibioticima te nije detektirano prisutstvo gena koji kodiraju za produkciju biogenih amina. Iako su ova dva soja originalno bila grupirana u isti klaster, pokazali su različite tehnološke karakteristike. MRS_296 je pokazao brzu sposobnost acidifikacije mesnog supstrata, što je najvažniji preduvjet svake starter kulture. Iako niti jedan od izabranih sojeva nije pokazao sposobnost razgradnje sarkoplazmatskih proteina, kod MRS_296 je detektirana proteolitička aktivnost na mediju s obranim mlijekom. Soj C_7d_13, nije pokazao dobru sposobnost acidifikacije, ali je pokazao zadovoljavajuću lipolitičku i peptidaznu aktivnost, svojstva koja su nedostajala kod MRS_296. Oba soja su pokazala antimikrobno djelovanje prema velikom broju testiranih bakterija. Izabrane autohtone starter kulture su dodane u mesnu smjesu za pripremu kobasica (15 kg) s brojem vijabilnih stanica od 9,34 og cfu/g (MRS_296) i 9,30 log cfu/g (C_7d_13) dok je neinokulirana smjesa služila kao kontrola. Kako bi se pratilo preživljavanje dodanih startera u kobasicama, izolati su izdvojeni na medijima selektivnima za BMK, prikupljeni i genotipizirani pomoću rep-PCR reakcije. Rep-PCR metodom je bilo moguće usporediti obrasce dodanih startera s obrascima prikupljenih sojeva, odnosno, bilo je moguće na ovaj način pratiti preživljavanje starter kultura. Velika većina sojeva (86,49 %) izoliranih iz kobasica s dodanim starterima je imala rep-PCR obrasce koji odgovaraju obrascima dodanih startera, što pokazuje da su dodani starteri preživjeli tijekom čitavog procesa proizvodnje kobasica. Međutim, budući da nije moguće razlikovati rep-PCR obrasce između MRS_296 i C_7d_13, nije moguće zaključiti da li su oba soja preživjela. Rezultati potpune mikrobiološke analize ukazuju na efikasnost primjenjenih starter kultura, odnosno, pokazuju da je primjenom startera kontroliran rast enterobakterija, koliformnih bakterija i L. monocyogenes kod inokulirane grupe (šarže), u kojoj su pH vrijednost i koncentracija tiramina bili značajno (p