Molekularni mehanizmi prijenosa i biološki učinci fenolnih derivata u vrsti Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.

Phenolic derivatives have many important roles in plants, yet mechanisms of their transport and all biological activities are still not elucidated. In scope of this dissertation, the transport abilities and certain biological activities of two types of phenolic derivatives (selected flavonoids and salicylic acid) were investigated. For research purposes, spectrophotometric methods were used, fluorescence microscopy, gass chromatography coupled with mass spectrometry, high performance liquid chromatography, and quantitative real time polymerase chain reaction. It was found that the complexation of quercetin with europium improves the long distance transport ability of quercetin. The involvement of this complex in certain aspects of Arabidopsis pathological states was further tested. Satellite-associated Cucumber mosaic virus (CMVsat) double stranded RNAs were found to specifically interact with this complex by degrading it into free quercetin. It was observed that the complex could moderate symptom development in Plasmodiophora brassicae-infected Arabidopsis. Another flavonoid, kaempferol, was shown to be involved in Arabidopsis thaliana-CMVsat interaction. Intriguing, in scope of this dissertation it was found that some compounds from flavonoid biosynthetic pathway are needed for CMVsat accumulation in Arabidopsis. Regarding salicylic acid, it was found that in Arabidopsis infected with P. brassicae it is synthesized from chorismate, and long distance transported in methylated form (as methyl-salicylate). The quantitative PCR analysis revealed that the expression of gene for isochorismate synthase and the expression of gene for salicylic acid methyltransferase were induced upon infection with P. brassicae. In Arabidopsis infected with CMVsat, salicylic acid is also transported as methyl-salicylate, but the transport rate and accumulation of salicylic acid are quite different than in Arabidopsis infected with P. brassicae.Biljke proizvode različite sekundarne metabolite. Sekundarne metabolite se u početku smatralo tek nusproduktima primarnog metabolizma (metabolizma ugljikohidrata, proteina, aminokiselina i lipida) koji se nakupljaju u biljnoj stanici zbog nedostatka djelotvornog sustava za njihovo izlučivanje. Međutim, uskoro je otkriveno da iako nisu neophodni za preživljavanje biljke, sekundarni metaboliti su joj potrebni za normalno funkcioniranje te joj mogu omogućiti bolju prilagodbu na novonastale uvjete. Sastav sekundarnih metabolita u biljci je kompleksan, ovisi o vrsti tkiva i organa te o stadiju razvoja biljke, razlikuje se između pojedinačnih biljaka i populacija (Paiva, 2000; Pichersky i Gang, 2000; Lattanzio, 2003; Osbourn, 2003, Wink, 2003). Sekundarne metabolite općenito dijelimo na fitoanticipine (konstitutivni, sintetiziraju se tijekom normalnog razvoja biljnih tkiva) i fitoaleksine (sintetiziraju se pod utjecajem nekog oblika stresa). Jednu od najvažnijih i najzastupljenijih skupina sekundarnih metabolita čine fenolni spojevi. U biljkama fenolni spojevi bivaju sintetizirani iz primarnih metabolita (prvenstveno aminokiselina i ugljikohidrata) procesima metilacije, hidroksilacije i glikozilacije (Korkina, 2006) kao produkti biosintetskog puta šikiminske kiseline i metabolizma fenilpropanoida. Biljkama fenolni spojevi služe za pigmentaciju, rast, razmnožavanje, signaliziranje, različite obrambene odgovore spram biotičkog i abiotičkog stresa te mnoge druge procese (Weisshaar i Jenkins, 1998; Winkel-Shirley, 2001; Forkmann i Martens, 2001). Zbog njihovih iznimnih svojstava, fenolni spojevi čine skupinu najistraživanijih biljnih bioaktivnih tvari te ih se koristi kao modelne spojeve u različitim područjima istraživanja. U skupinu fenolnih spojeva pripada nekoliko tisuća kemijskih spojeva, od kojih preko 10000 čine flavonoidi (Tahara, 2007). Među fenolnim spojevima najviše su istraživani flavonoidi i salicilna kiselina zbog njihovih iznimnih pozitivnih bioloških učinaka u biljnom organizmu. Flavonoidi su fenolni spojevi širokog spektra pozitivnih bioloških učinaka. Nijedna druga skupina sekundarnih metabolita ne pokazuje toliko učinaka na rast i razvoj biljnog organizma. Flavonoidi djeluju kao snažni antioksidansi te štite biljku od slobodnih radikala (Rice-Evans i sur., 1997; Shahidi i Wanasundara, 1992). Oni utječu na rast i razvoj biljnog organizma regulirajući polarni transport auksina (Fischer i sur., 1997; Murphy i sur., 2000; Brown i sur., 2001; Buer i sur., 2004; Rusak i sur., 2010). Flavonoidi djeluju kao signalne molekule među organizmima, stanicama te unutar stanica (Eckardt, 2006, Moscatiello i sur., 2010; Hassan i Mathesius, 2012). Oni štite biljku od UV zračenja, biotičkog i abiotičkog stresa (Reuber i sur., 1996; Shirley, 1996; Rozema i sur., 1997; Treutter, 2006). U proteklih deset godina dokazano je da se neke pozitivne biološke učinke flavonoida može dodatno pojačati njihovim vezivanjem s određenim metalima, npr. flavonoid-metal kompleksi znatno učinkovitije štite biljku od slobodnih radikala u usporedbi s flavonoidima od kojih potječu (Kostyuk i sur., 2001). Štoviše, sposobnost flavonoida da keliraju metale odgovorne za sintezu kisikovih i dušikovih reaktivnih spojeva također doprinosi njihovim antioksidativnim biološkim učincima. Osim njihova boljeg antioksidativnog djelovanja, kompleksi flavonoida s metalima su hidrofilniji i time bolje topivi u vodenim otopinama od čistih flavonoida (Afanas'ev i sur., 1989). Nadalje, kompleksi flavonoida s metalima učinkovitije uklanjaju superoksidne ione od čistih flavonoida (Kostyuk i sur., 2004). Također, dokazano je da se kompleks flavonoida kvercetina s lantanom znatno jače veže za dvolančane RNA molekule virusa mozaika krastavca s pridruženim satelitom u usporedbi sa slobodnim kvercetinom, što je potaknulo pretpostavku da bi vezivanje flavonoida s metalima moglo pojačati njihovo antiviralno djelovanje (Rusak i sur., 2009). Za sintezu kompleksa flavonoid-metal često se koriste rijetki zemljani metali zbog male toksičnosti ovih kompleksa te zbog činjenice da ti metali ne pokazuju kumulativni učinak u in vivo uvjetima. Iako jedan od najmanje zastupljenih rijetkih zemljanih metala, od 2002. godine do danas potvrđena je prisutnost europija u staničnoj membrani, citoplazmi i mitohondrijima određenih biljnih vrsta (McKenna i sur., 2002; Gao i sur., 2003; Fellows i sur., 2003). Svojstvo fluorescencije lantanida (jedne od skupina rijetkih zemljanih metala), prije svega europija, iznimno je korisno u istraživanjima njihovih kompleksa s biomolekulama (Mundoma and Greenbaum, 2003). Tian i sur. su 2003. i 2004. godine dokazali određene biološke učinke egzogeno apliciranog europija na korijen graška (Lathyrus sativus L.). Europij, naime, može aktivirati proteolitičke enzime te može pojačati aktivnost Na+/K+-ATPase mijenjanjem omjera Na+/K+. Nadalje, Zeng i sur. su 2003. godine dokazali da europij može poticati prijenos Ca2+ kroz plazmatsku membranu te tako utjecati na razvoj biljnog organizma. Yang i sur. su 2005. godine objavili da mala koncentracija europija (konkretno 0.1 μg mL-1) može potaknuti rast kalusa i sintezu flavonoida u vrste Glycyrrhiza uralensis L. Nedavno je objavljeno da je antitumorsko djelovanje kompleksa kvercetina s europijem znatno jače od onog čistog kvercetina (Fan i sur., 2012). U sklopu ove disertacije sintetiziran je kompleks kvercetin-europij u biološkom puferu te je spektrofotometrijskim metodama dokazano da isti različito reagira s jednolančanim i dvolančanim biološkim RNA molekulama. Dokazano je da dvolančane RNA molekule virusa mozaika krastavca s pridruženim satelitom specifično reagiraju s ovim kompleksom razgrađujući ga na slobodni kvercetin. Metodom fluorescencijske mikroskopije potvrđeno je da kompleks poboljšava sposobnost prijenosa kvercetina kroz korijen vrste Arabidopsis thaliana. Nadalje, primijećeno je da kompleks može ublažiti razvoj simptoma u Arabidopsisu inficiranom protistom Plasmodiophora brassicae. Osim kvercetina, drugi flavonoid čije je biološko djelovanje istraživano u sklopu ove disertacije jest kempferol. Rezultati su pokazali da kempferol sudjeluje u obrambenom odgovoru Arabidopsisa spram virusa mozaika krastavca s pridruženim satelitom. Naime, metodom tekućinske kromatografije visoke moći razlučivanja potvrđeno je da je u inficiranim Arabidopsisima znatno manja količina kempferola nego u odgovarajućim kontrolnim zdravim biljkama. Očito je da se kempferol troši u nekom od obrambenih mehanizama zaražene biljke domaćina, što je u skladu s već objavljenim rezultatima o antifitoviralnom djelovanju pojedinih flavonoida (Rusak i sur., 1997). S druge strane, u sklopu disertacije testiran je i suprotan proces, učinak sadržaja endogenih flavonoida na sposobnost razmnožavanja virusa mozaika krastavca s pridruženim satelitom u Arabidopsisu. U tu svrhu korištene su određene TRANSPARENT TESTA (tt) mutante Arabidopsisa koje sadrže mutacije u genima odgovornim za sintezu pojedinih enzima flavonoidnog biosintetskog puta (Koornneef i sur., 1982; Koornneef, 1990; Shirley i sur., 1995). Izrazito zanimljivo, utvrđeno je da se virus mozaika krastavca s pridruženim satelitom ne razmnožava u Arabidopsisu koji sadrži mutaciju u genu odgovornom za sintezu prvog enzima flavonoidnog biosintetskog puta (halkon sintaze (CHS)) te stoga ne posjeduje niti jedan flavonoid. Prema tome, dok neki flavonoidi imaju antifitoviralno djelovanje (Rusak i sur., 1997), neki od spojeva iz flavonoidnog biosintetskog puta su, upravo suprotno, potrebni za umnažanje virusa mozaika krastavca s pridruženim satelitom u Arabidopsisu. Nadalje, u sklopu ove disertacije testiran je učinak određenih endogenih i egzogeno apliciranih flavonoida na razvoj kalusnog tkiva Arabidopsisa. Dokazano je da endogeni naringenin u tt6 mutanti spriječava klijanje sjemenki Arabidopsisa. Također, primijećeno je da egzogeno aplicirani kempferol utječe na razvoj kalusa znatnije nego kvercetin ili naringenin. Posebno je taj učinak izražen kod sjemenki koje već u sebi sadrže endogeni kempferol, što upućuje na pretpostavku da je prijenos određenog egzogeno apliciranog flavonoida učinkovitiji kroz ona tkiva koja su sposobna isti i sama sintetizirati. Uz flavonoide, salicilna kiselina je jedan od najvažnijih fenolnih spojeva koji sudjeluju u obrambenim procesima biljnog organizma. Zanimljivo, iako je salicilna kiselina sama po sebi citotoksična i nema sposobnost prijenosa na veće udaljenosti kroz biljku (Vernooij i sur., 1994; Peer i sur., 2007), derivatizacijom iste (glukozilacijom, metilacijom, konjugacijom s aminokiselinama, sulfonacijom ili hidroksilacijom) unutar biljne stanice nastaju derivati koji nisu citotoksični te koji omogućavaju prijenos salicilne kiseline na veće udaljenosti (Vernooij i sur., 1994; Peer i sur., 2007) i njeno skladištenje (Dean i sur., 2003; 2005; Dean i Mills, 2004). Budući su prijenos i biosintetski put salicilne kiseline specifični za svaki biljka-patogen sustav, u sklopu ove disertacije proučavan je mehanizam prijenosa salicilne kiseline kroz Arabidopsis inficiran lokalnim patogenom (protist Plasmodiophora brassicae koji obitava u korijenu Arabidopsisa) te kroz Arabidopsis inficiran sustavnim patogenom (virus mozaika krastavca s pridruženim satelitom koji se od mjesta infekcije sustavno širi na novonastale dijelove Arabidopsisa). Utvrđeno je da se u oba slučaja salicilna kiselina prenosi na veće udaljenosti u obliku metil-salicilata. Međutim, učinci ovih dvaju patogena na intenzitet prijenosa i količinu salicilne kiseline u Arabidopsisu je znatno različit. Ovaj rezultat ukazuje na činjenicu da u istoj biljci domaćinu različiti patogeni imaju različit učinak na prijenos i skladištenje glavnog obrambenog spoja biljke. Također, u sklopu disertacije proučen je biosintetski put salicilne kiseline u P. brassicae-inficiranom Arabidopsisu. Dokazano je da se salicilna kiselina u P. brassicae-inficiranom Arabidopsisu primarno sintetizira iz korizmata, no u najvišem stupnju infekcije, kada je biljkama za obrambene reakcije potrebna najveća količina salicilne kiseline, manji dio iste može se sintetizirati, uz korizmat, čak i iz fenilalanina. Ovaj rezultat u skladu je s rezultatom koji su objavili Dempsey i sur. 2011. godine; oni su naime zaključili da Arabidopsis pod utjecajem stresa sintetizira salicilnu kiselinu primarno iz korizmata, dok fenilalanin također može biti korišten kao supstrat ali u značajno manjoj mjeri. Nadalje, za potrebe disertacije, proučen je učinak infekcije Arabidopsisa protistom P. brassicae na ekspresiju određenih gena povezanih s procesima prijenosa i biosinteze salicilne kiseline. Metodom lančane reakcije polimeraze u stvarnom vremenu (Real-Time PCR) utvrđeno je da je ekspresija gena koji kodira protein za metilaciju salicilne kiseline (At02174493_g1 označen kao SAMT1) povećana nakon infekcije Arabidopsisa spomenutim patogenom. Ovaj rezultat je u skladu s prethodno dokazanom činjenicom da se salicilna kiselina prvo mora metilirati kako bi se učinkovitije mogla prenositi kroz P. brassicae-inficirani Arabidopsis. Ekspresija gena koji kodira protein izokorizmat-sintazu (At02286260_g1 označen kao ICS1) također je povećana nakon infekcije ovim patogenom i taj je rezultat u skladu s prethodno dokazanom činjenicom da se u ovom sustavu salicilna kiselina sintetizira primarno iz korizmata. Ekspresija gena odgovornog za glukozilaciju salicilne kiseline (At02327040_gH označen kao SAGT) u dotičnom biljka-patogen sustavu ostaje za sada nerazjašnjena budući je normalizacija ekspresije ovog gena u odnosu na dvije odabrane endogene kontrole (At02200102_s1 označen kao F-box i At02183416_g1 označen kao YLS8) dala oprečne rezultate. Dobiveni rezultati u sklopu ove disertacije upućuju na moguće nove biološke učinke kompleksa kvercetin-europij te kempferola. Također, dokazano je da je metil-salicilat prijenosni oblik salicilne kiseline u P. brassicae- i CMVsat-inficiranom Arabidopsisu, uz naglasak da je intenzitet prijenosa i količina salicilne kiseline, s obzirom na kontrolne neinficirane biljke, između ova dva sustava značajno različit. Salicilna kiselina se u P. brassicae-inficiranom Arabidopsisu primarno sintetizira iz korizmata, no u najvišem stupnju infekcije, kada je biljkama za obrambene reakcije potrebna najveća količina salicilne kiseline, manji dio iste može se sintetizirati, uz korizmat, čak i iz fenilalanina. Ekspresija gena koji kodira protein za metilaciju salicilne kiseline i gena koji kodira protein izokorizmat-sintazu je nakon infekcije ovim patogenom povećana