Detection, Identification and Molecular Typing of Canine Papillomavirus in Croatia

Papilomavirusi pasa uzrokuju niz razlicitih klinickih promjena opisanih u svijetu, no najcešce prepoznato je stvaranje bradavica u usnoj šupljini i na koži. U posljednje vrijeme cesta je pojava neoplazmi nazvanih epidermalni pigmentirani plakovi koji su potaknuti papilomavirusom. Do danas je u svijetu izolirano 16 razlicitih virusnih tipova. Premda klinicki izrazito specificne i lako prepoznatljive do danas u Republici Hrvatskoj nikada nije napravljeno istraživanje o ucestalost virusne etiologije u nastanku bradavica. Istraživanje o zastupljenosti pojedinog tipa pseceg papilomavirusa napravljeno je pretraživanjem uzoraka tkiva 22 papiloma pasa koji su kirurški uklonjenih tijekom klinicke obrade životinja. Svi uzorci su dostavljeni u virusološki laboratorij Zavoda za mikrobiologiju i zarazne bolesti sa klinikom Veterinarskog fakulteta gdje se provela daljnja obrada sa svrhom izrade autovakcine. Prema lokalizaciji promjena pet pasa je imalo bradavicu u usnoj šupljini, jedan na gornjoj vjedi, a ostatak bradavica uklonjeno je s kože životinja. Pošto se papilomavirusi ne mogu izolirati na stanicnim kulturama, za etiološku dijagnozu korištena je lancana reakcija polimerazom u svrhu dokazivanja virusne DNK. Za izdvajanje virusnog DNK korišten je komercijalni komplet QIAamp DNA Mini Kit prema uputama proizvodaca. Molekularna dijagnostika CPV nacinjena je PCR metodom korištenjem u ranijim istraživanjima opisanih pocetnica FAP59 i FAP64. Pocetnice su specificne za L1 gen ORF regije virusa papilomatoze. Dobiveni PCR produkti poslani su na sekvencioniranje, a odredeni nukleotidni slijedovi usporedeni su s nukleotidnim slijedovima do sada tipiziranih CPV dostupnim u GeneBank radi filogenetske analize. U 18 od 22 uzoraka je dobivena pozitivna reakcija, dok je cetiri uzorka pokazalo nespecificnu reakciju. Virusna etiologija dokazana je u 81.9% pretraženih uzoraka. U uzorcima papiloma iz usne šupljine i jednog s vjede je dokazan virus, dok se u kožnim promjenama virus dokazao u 12 od 16 (75%). Svi tipizirani CPV filogenetskom analizom pripadaju CPV tip 1, unutar skupine Lambdapapillomavirus. Uocena je minimalna medusobna razlikama na nukleotidnoj, ali i aminokiselinskoj razini. 59 Istraživanjem je dokazano da je vecina papilomatoznih promjena u pasa u RH uzrokovana CPV tip 1. Promjene bez potvrdene virusne etiologije dokazane su na koži. Dokazivanjem pripadnosti svih pretraženih uzoraka, CPV 1 tipu virusa, neovisno o lokalizaciji izazvane promjene kao ni geografskog podrucja zaprimanja uzoraka, postavlja se temelj za izradu autovakcine bazirane na CPV1 tipu virusa,radi zaštite neimunih životinja kao i ubrzavanja procesa oporavka vec oboljelih.Canine papilomavirus is common cause of wart formation in oral cavity and skin of dogs. By now, 16 different virus types have been isolated. Although clinically highly specific and easily recognized, an incidence of viral papilomas in dog population in Croatia has been never determined. A total of 22 papiloma samples sent to Virology laboratory, Faculty of Veterinary Medicine, Zagreb, for the autovaccine production were tested. Samples were surgically removed at local veterinary clinics: five from oral cavity, one from the upper eyelid, and the rest were removed from the skin. Polymerase chain reaction (PCR) was used to prove viral DNA, and thus confirm the viral aetiology. Sample DNA was isolated using commercial kit QIAamp DNA Minit Kit, according to manufacturers' instructions. For the specific amplification of L1 gene ORF region of the papillomavirus earlier described primers FAP59 and FAP64 were used. The obtained PCR products were sequenced and compared with corresponding nucleotide sequences available in the GeneBank for the phylogenetic analysis. Viral aetiology was proven in 18 out of 22 samples (81.9%) of analysed samples. The virus was identified in all of the samples obtained from oral cavities, the sample taken from the upper eyelid and in 12 out of 16 (75%) skin lesions. Sequences showed substantial difference at both nucleotide and amino-acid level even though amplified region is highly conserved one. All of the CPV isolates from this study belong to CPV type 1, in the group of Lambdapapillomavirus. Even based on small number of samples its clear most of papillomatous lesions in dogs in Croatia have viral aetiology. Interestingly all the lesions without confirmed viral aetiology have originated from a skin. Results of this research can be used as a guidance in a wart treatment and considerable variability of isolated CPV highlight advantage of autovaccine usage if immunotherapy is considered