Analiza transkriptoma mišijeg citomegalovirusa

Human cytomegalovirus (HCMV) is a ubiquitous human pathogen responsible for devastating congenital disease and life-threatening complications in immune-suppressed patients. Available treatments have many shortcomings and effective vaccine is still lacking. Major obstacles to progress in vaccine and antiviral drug development are (1) species specificity of HCMV, and (2) gaps in our understanding of viral genes and their interaction with host genes. First limitation is circumvented by the use of model animal viruses, especially murine cytomegalovirus (MCMV). We sought to alleviate the second problem by studying MCMV transcriptome using two approaches: classical cDNA library analysis and next generation sequencing (RNASeq). This dual analysis revealed incredible complexity of MCMV transcriptome, detected numerous novel viral spliced and unspliced transcripts as well as transcription from intergenic regions, and showed that expression levels of viral transcripts vary by several orders of magnitude. Unexpectedly, most top expressed genes were of unknown functions and were improperly annotated. Therefore, this analysis provides the first comprehensive overview of MCMV transcriptome, underscores the necessity of transcriptomic analyses in providing evidence-based genome annotation and could serve as the first step towards re-annotation of MCMV genome. The most abundant viral transcript, recently identified as a noncoding RNA regulating cellular microRNAs [18, 84], was shown to also code for a novel protein(s). This is the first viral transcript that functions both as a noncoding RNA and an mRNA. In this work it is also shown that this transcript’s 5’ UTR plays a role in NK cell recognition of infected cells via activating Ly49 receptors. Analysis of host transcriptome showed that lytic infection revealed that many unexpected gene groups are disregulated in response to the infection. Such systematic analysis may shed new light on cytomegalovirus pathogenesis and suggests new areas of research.Svrha istraživanja Humani citomegalovirus široko je rasprostranjen patogen, a posebno je opasan za trudnice, novorođenčad i imunosuprimirane pacijente. Nažalost, efikasnog cjepivo nema, a postoji potreba i za efikasnijim i manje toksičnim antiviralnim lijekovima. Glavne prepreke razvoju novih antiviralnih ljekova i cjepiva jesu: (1) specifičnost za vrstu i (2) praznine u našem znanju i razumjevanju virusnih gena, interakcijama virusnih gena i domaćina te kako te interakcije izazivaju bolest. Prva prepreka uspješno se nadvladava korištenjem animalnih virusa, posebice mišjeg citomegalovirusa (MCMV). S ciljem nadvladavanja druge prepreke u ovom je radu provedena detaljna analiza transkriptoma mišjeg citomegalovirusa (MCMV) te analiza transkriptoma stanica domaćina tijekom litičke infekcije citomegalovirusom. Materijali i metode Transkriptom MCMV analiziran je na dva načina: klasičnom analizom cDNK knjižnice i sekvencioniranjem dobivenih klonova te analizom transkriptoma uz pomoć sekvencioniranja nove generacije (odnosno RNK-sekvencioniranjem, eng. RNASeq) koja omogućava paralelno praćenje i transkriptoma domaćina uz transkriptom virusa. Analiza transkriptoma domaćina rezultira vrlo dugačkim listama diferencijalno reguliranih gena iz kojih je teško izvući neko biološko značenje. Stoga su liste diferencijalno reguliranih gena domaćina podvrgnute analizi termina genske ontologije (eng. gene ontology analysis odnosno GO analiza) i analizom dereguliranih bioloških puteva. Transkripcijski kompleksne regije genoma MCMV dodatno su analizirane Northern hibridizacijom i metodom RT-PCR dok je korelacija između količine transkripata i proteina odabranih gena analizirana metodom Western blot. Na kraju, funkcija novog, prekrojenog transkripta MAT (most abundant transcript; najzastupljeniji transkript) analizirana je uz pomoć reporterskih stanica koje nose aktivacijske Ly49 receptore. Rezultati Ovaj rad predstavlja prvu detaljnu analizu transkriptoma MCMV-a korištenjem komplementarnih metoda analize cDNK knjižnice i RNASeq analizom, a rezultirala je identifikacijom brojnih novih transkripata MCMV, uključujući i nove prekrojene transkripte kao i transkripte koji se prepisuju sa intergenskih regija. Ustanovljeno je da najjače izraženi virusni transkripti imaju nepoznatu funkciju i često su pogrešno anotirani. Najjače izražen transkript (tzv. MAT transkript) prvi je virusni transkript koji ima i kodirajuću i nekodirajuću funkciju. Naime, nedavno je pokazano da se na njegovom 3' netranslatiranom kraju (3' UTR, od eng. 3' untranslated region) nalazi vezno mjesto za staničnu mikro-RNK [18, 84], dok je u ovom radu pokazano da on također kodira i barem još dva proteina. Uz ove dvije navedene funkcije, u ovom je radu otkriveno da je 5' netranslatirani kraj (5'UTR) MAT transkripta bitan virusni faktor kojeg na inificranim stanicama prepoznaju stanice prirodne ubojice pomoću aktivacijskih receptora Ly49. Analiza transkriptoma stanica domaćina pokazala je da litička infekcija virusom MCMV izaziva izrazite promjene u ekspresijskom profilu gena domaćina: ekspresija gotovo trećine gena miša promijenila se uslijed infekcije virusom MCMV. Geni čija se ekspresija pojačava tijekom infekcije uglavnom su geni uključeni u upalne i imunološke procese, međutim neki pripadaju i skupini transkripcijskih faktora te genima povezanim s razvojem i diferencijacijom. Ovi rezultati u skladu su s dosadašnjim saznanjima o CMV-u kao virusu koji izaziva upalu te uzrokuje razvojne poremećaje tijekom kongenitalnih infekcija. Brojni geni čija se ekspresija smanjila tijekom infekcije povezani su sa funkcijama čija je uloga u infekciji za sada nepoznata poput dugačkih intergenskih nekodirajućih RNK, antisense RNK ili malih nukleolarnih RNK. GO analiza rezultirala je detekcijom disreguliranih bioloških puteva koji još do sada nisu bili povezani sa citomegalovirusnom infekcijom, a koji imaju potencijal rasvjetljavanja nekih nepoznanica u patogenezi citomegalovirusne infekcije. Zaključci Jedno od najznačajnijih otkrića u ovome radu jest dokaz izuzetne kompleksnosti transkriptoma MCMV-a koji dosad nije bio ovako sustavno istraživan niti su postojale transkriptomske mape. Ova analiza transkriptoma MCMV-a predstavlja važan prvi korak ka razvoju boljih genomskih mapa i reanotaciji genoma MCMV-a. Analiza odgovora stanica domaćina na infekciju dala je novi pogled na molekularne interakcije između virusa i domaćina i otvorila brojna nova područja istraživanja koja imaju potencijal da p pronađu nove mogućnosti liječenja bolesti izazvanih CMV-om. Ključne riječi mišji citomegalovirus, MCMV, transkriptom, ekspresija gena, izbjegavanje imunološko