Studio in vitro della possibile platinazione di acidi nucleici operata da polimerasi e complessi di Pt(II) con basi puriniche

Tutor per le attività di Ricerca svolte dalla Dr. Vita Mariagrazia Vecchio nell’ambito della borsa di ricerca assegnata dal Consorzio Interuniversitario di Ricerca sulla Chimica dei Metalli nei Sistemi Biologici, CIRCMSB, tematica Nuovi Farmaci in Oncologia per la ricerca dal titolo: Studio in vitro della possibile platinazione di acidi nucleici operata da polimerasi e complessi di Pt(II) con basi puriniche. BREVE DESCRIZIONE DEL PROGETTO Tra i farmaci utilizzati nel trattamento antitumorale, i complessi del platino meritano indubbiamente un riguardo particolare soprattutto nel trattamento di tumori solidi dell’apparato urogenitale. Il meccanismo con cui si esplica l’attività antitumorale del cisplatino, non è ancora del tutto noto pur sapendo che è particolarmente importante la capacità di molti complessi di questo metallo di legare le basi puriniche del DNA. Lunghe discussioni sono presenti in letteratura sul come e sul perché il cisplatino e i suoi analoghi di uso clinico, possano raggiungere e platinare il DNA nucleare in cellula. E’ noto anche come la formazione di addotti (mono o bis), soprattutto con basi puriniche del DNA possa interferire con i normali processi di replicazione cellulare, inducendo apoptosi. Per il cisplatino è noto come l’ingresso in cellula attraverso la membrana cellulare possa avvenire sia per diffusione passiva che per fenomeni di trasporto attivo scoperti di recente. Uno stadio chiave per comprendere il meccanismo di platinazione del DNA resta comunque la comprensione dal punto di vista chimico di ciò che avviene nel citoplasma cellulare prima che il DNA possa essere platinato, visto che prima di incontrare il DNA il cisplatino incontra specie ben più reattive (molecole S e N donatrici). In questo contesto si inserisce il nostro progetto di ricerca, cogliendo un aspetto finora non considerato in letteratura che è la possibile ipotizzabile formazione di addotti di varia natura con basi puriniche normalmente presenti nel citoplasma cellulare. Infatti in cellula ovunque sono presenti derivati purinici con funzioni varie tra cui anche la costituzione di una riserva di building blocks per la sintesi di nuovo DNA o RNA in processi di replicazione. Una prima parte del lavoro consisterà nello studio dell’attività citotossica di complessi in cui il platino è legato direttamente a basi puriniche del DNA. Successivamente si valuterà il possibile inserimento nel DNA di nuova sintesi di complessi preventivamente legati alle basi nucleiche del DNA, normalmente presenti in cellula (nucleotide monofosfato, difosfato o trifosfato nelle forme normali o desossi). Infatti pensiamo che non sia giusto escludere a priori un attacco della mono-acquo specie formata in cellula ad esempio dal cisplatino, cis-[(NH3)2(H2O)Cl]+, alle basi puriniche libere, presenti nell’ambiente cellulare, prima che al DNA. Questa idea ci sembra rafforzata dal fatto che, in genere, il DNA è presente in cellula prevalentemente nella forma a doppio filamento poco reattiva e sicuramente meno reattiva delle basi libere, se non altro per problemi di ingombro sterico. E’ questo tipo di considerazioni insieme ad incoraggianti esperimenti preliminari che hanno suggerito di approfondire, lo studio del possibile inserimento di basi già platinate nel DNA di nuova sintesi. Chiaramente l’obiettivo ultimo ed ancora molto lontano di questo lavoro sarà di comprendere se tali processi possano avere un ruolo nell’esplicazione in vivo dell’attività antitumorale dei complessi del platino attualmente in uso clinico. E’ noto che derivati nucleotidici del tipo dNTP sono inglobati nel DNA di nuova sintesi da varie DNA polimerasi. Nello screening preliminare effettuato prima di presentare questo progetto si è scelta una polimerasi procariotica facilmente reperibile e di basso costo come la Taq polimerasi, utilizzando il complesso [Pt(dien)(N7-5’-dGTP)] come sistema modello di complesso con basi puriniche da poter inglobare nel DNA di nuova sintesi. Con tecniche analoghe alla PCR (polymerization chain reaction) si è inserita con successo la base platinata in vari oligonucleotidi con circa 100 bp, confermando l’avvenuta platinazione con tecniche di gel elettroforesi utilizzando gel di poliacrilammide, per separare catene di lunghezza diversa ottenute nel corso dei processi di polimerizzazione, e di assorbimento atomico del platino presente nell’oligo (per individuare la posizione degli oligo sul gel elettroforetico si sono utilizzati marcatori fluorescenti). Ovviamente necessita un’ulteriore conferma di quanto osservato e a questo riguardo pensiamo di ripetere gli esperimenti detti esaminando i prodotti ottenuti anche con tecniche di autoradiografia, marcando con isotopi radioattivi gli oligo, al fine di ottenere una maggiore risoluzione nella determinazione della loro posizione nel gel elettroforetico. Per determinare la presenza effettiva del platino negli oligo purificati per elettroforesi si utilizzeranno tecniche di assorbimento atomico che pensiamo in futuro di abbinare alla spettrometria di massa come l’ESI e la MALDI. Si può prevedere successivamente alla fase di verifica in vitro dei processi di platinazione menzionati anche una fase di verifica, in vivo. Ovviamente obiettivo ultimo di questo progetto è di verificare se il nuovo meccanismo di platinazione descritto possa operare anche in vivo nei mammiferi e nell’uomo. Ciò potrebbe suggerire nuove strategie per la realizzazione di nuovi farmaci antitumorali magari efficaci contro forme tumorali resistenti e dotati di minore tossicità ed effetti collaterali