Antwort humaner parodontaler Ligamentzellen auf gleichzeitige Stimulierung mit TLR2 und TLR3 Agonisten

Hintergrund und Ziele:<br />Parodontitis ist eine entzündliche Erkrankung des Zahnhalteapparates, die durch pathogene orale Biofilme ausgelöst wird. Die Veränderung des Biofilms von einem gesunden symbiotischen zu einem dysbiotischen Charakter wird gegenwärtig als ein wesentlicher ätiologischer Faktor der Parodontitis angesehen und führt zu einer unangemessenen und destruktiven Immunantwort. Die Komponenten des Biofilms werden von spezifischen Rezeptoren des angeborenen Immunsystems erkannt, insbesondere von Toll-like-Rezeptoren (TLRs). TLRs sind eine Familie von Proteinen, die spezifische konservierte Teile von Bakterien und Viren erkennen. Die Aktivierung aller TLRs führt, mit Ausnahme von TLR3, über einen Myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88) -abhängigen Signalweg zu einer Entzündungsreaktion, wohingegen TLR3 ausschließlich auf einen MyD88-unabhängigen Mechanismus angewiesen ist. TLR4 ist das einzige Mitglied der TLR-Familie, das sowohl über MyD88-abhängige als auch MyD88-unabhängige Wege aktiviert werden kann. Da pathogene Biofilme zahlreiche Bakterienarten und Viren enthalten, können sie gleichzeitig verschiedene TLRs aktivieren. Die Reaktion von Wirtszellen auf gleichzeitige Stimulierung verschiedener TLRs wurde jedoch bisher nicht hinreichend untersucht. Daher beschäftigten wir uns in der vorliegenden Arbeit mit der Reaktion humaner parodontaler Ligamentzellen (hPDL) auf gleichzeitige Stimulierung mit dem TLR2-Agonisten Pam3CSK4 und dem TLR3-Agonisten Poly-I:C, die über unterschiedliche Signalwege zur Aktivierung führen. Weiters wurde ein Vergleich der Reaktion bei gleichzeitiger Stimulierung mit beiden Agonisten mit jener nach Stimulierung mit TLR4-Agonisten Escherichia coli (E. coli) Lipopolysaccharid (LPS) angestrebt, der bekannterweise beide Signalwege aktivieren kann.<br /><br />Material und Methoden:<br />Humane parodontale Ligamentzellen wurden von fünf verschiedenen Spendern isoliert. Die Zellen wurden mit dem TLR2-Agonisten Pam3CSK4 (0,01 und 1 g/ml), TLR3-Agonisten Poly-I:C (0,1 und 1 g/ml) und ihren verschiedenen Kombinationen für 24 Stunden stimuliert. Die resultierende Produktion der proinflammatorischen Mediatoren Interleukin 6 (IL6), Interleukin 8 (IL8) und Monozyten-chemotaktisches Protein 1 (MCP1) wurde auf Gen- und Proteinebene durch real-time quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) bzw. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) gemessen. Die Reaktion auf gleichzeitige Stimulierung mit TLR2- und TLR3-Agonisten wurde mit jener nach Stimulierung mit E. coli LPS (1 g/ml) verglichen.<br />Ergebnisse:<br />Sowohl TLR2- als auch TLR3-Agonisten induzieren die Produktion von proinflammatorischen Mediatoren durch hPDL-Zellen. Die Reaktion von hPDL-Zellen auf gleichzeitige Stimulierung mit TLR2- und TLR3-Agonisten war im Vergleich zur Stimulierung mit einzelnen Stimuli im Allgemeinen signifikant höher. Zusätzlich war die Reaktion von hPDL-Zellen auf gleichzeitige Stimulierung mit TLR2- und TLR3-Agonisten signifikant höher als jene auf TLR4-Agonist E. coli LPS.<br />Konklusion:<br />Unsere Daten zeigen, dass die Reaktion von hPDL-Zellen auf gleichzeitige Stimulierung mit TLR2- und TLR3-Agonisten eine Ergänzung ihrer Reaktion auf eine einzelne Stimulierung ist und zu einer extrem hohen Produktion von proinflammatorischen Mediatoren führt. Die Reaktion von hPDL-Zellen auf E. coli LPS war wesentlich geringer als die der Kombination von TLR2- und TLR3-Agonisten. Es liegt nahe, dass die Antwort auf TLR4-Agonisten zusätzliche Mechanismen aktivieren könnte, die zu einer Dämpfung der Entzündungsreaktion führen.Background and Objectives<br />Periodontitis is an inflammatory disease of tooth supporting tissues, which is initiated by pathogenic oral biofilms. Alteration of biofilm content from symbiotic to pathogenic is currently considered as a major etiological agent of periodontitis and leads to inappropriate and destructive immune response. The components of biofilms are recognized by specific receptors of innate immune system, particularly by toll-like receptors (TLRs). TLRs are a family of proteins, which recognize specific conserved parts of bacteria and viruses. Activation of all TLRs excepting TLR3 leads to inflammatory response through MyD88-dependent mechanisms, whereas TLR3 works exclusively through MyD88-independent pathways. TLR4 is the only member of TLRs family, which acts through both MyD88 dependent and MyD88-independent pathways. <br />Since pathogenic biofilms contain numerous bacterial species and viruses, it can activate different TLRs simultaneously. However, the response of host cells to simultaneous stimulation of different TLRs is investigated rather poorly. Therefore in the present study we investigated the response of human periodontal ligament cells (hPDLCs) to simultaneous stimulation with TLR2 agonist Pam3CSK4, which acts exclusively through MyD88-dependent pathway, and TLR3 agonist Poly-I:C, which acts exclusively through MyD88-independent pathway. Simultaneous effect of these two substances was compared with that of TLR4 agonists E. coli LPS, which is known to activate both signaling pathways.<br />Material and methods<br />Human periodontal ligament cells were isolated from five different donors. Cells were stimulated with TLR2 agonist Pam3CSK4 (0.01, 1 g/ml), TLR3 agonist Poly-I:C (0.1, 1 g/ml) and their different combinations for 24 h. The resulting production of pro-inflammatory mediators interleukin (IL)-6, IL-8, and monocyte chemoattractant protein (MCP1) was measured on gene and protein levels by qPCR and ELISA, respectively. The response to simultaneous stimulation with TLR2 and TLR3 agonists was compared to that of E. coli LPS (1 g/ml).<br />Results<br />Both TLR2 and TLR3 agonists induce production of pro-inflammatory mediators by hPDLCs. The response of hPDLCs to simultaneous stimulation with TLR2 and TLR3 agonists was generally significantly higher compared to stimulation with single stimuli. In addition, the response of hPDLCs to simultaneous stimulation with TLR2 and TLR3 agonists was significantly higher than that to TLR4 agonist E. coli LPS.<br />Conclusion<br />Our data show that response of hPDLCs to simultaneous stimulation with TLR2 and TLR3 agonists is an addition of their responses to single stimulation and results in extremely high production of pro-inflammatory mediators. The response of hPDLCs to E. coli LPS was substantially lower than that to combination of TLR2 and TLR3 agonists, which suggest that the response to TLR4 might activate some additional pathways resulting in dampening of inflammatory response.Paralleltitel laut Übersetzung der VerfasserinMedizinische Universität Wien, Diplomarbeit, 2018(VLID)252360