Unraveling the mechanism of action of new psychoactive substances and their phase 1 metabolites

Missbrauch von Psychostimulanzien stellt ein globales und im Wachsen begriffenes Problem dar. Die gleichzeitige Abwesenheit von effektiven Behandlungsstrategien, um die Abhängigkeit von diesen Substanzen zu behandeln, verleiht diesem Problem zusätzliche Brisanz. Neben den etablierten und intensiv beforschten Psychostimulanzien, wie etwa Cocain oder 3,4-Methylenedioxymethylamphetamin (MDMA; „ecstasy“), drängen neue psychoaktive Substanzen (NPS) auf die globalen Drogenmärkte. Diese auch als „Badesalze“ und „Research Chemicals“ bezeichneten Substanzen werden als legale Alternativen zu den regulierten und illegalen Stimulanzien konsumiert. Aufgrund von chemischen Modifikationen unterwandern NPS die Gesetzgebung und bringen eine Vielfalt an Substanzen hervor, deren pharmakologisches und toxikologisches Profil gänzlich unbekannt ist. Die stimulierende und belohnende Wirkung von Psychostimulanzien basiert auf deren Fähigkeit, die extrazelluläre Konzentration der Monoamine Dopamin, Serotonin und Noradrenalin zu erhöhen. Unter physiologischen Bedingungen bewerkstelligen hochaffine Transportproteine die Wiederaufnahme dieser Neurotransmitter und terminieren somit deren Wirkung an pre- und postsynaptischen Rezeptoren. Die Transporter für Dopamin (DAT), Noradrenalin (NET) und Serotonin (SERT) stellen den Angriffspunkt für Psychostimulanzien dar, wobei diese unterschiedliche Wirkungen an den Transportproteinen entfalten: Cocain-artige Substanzen agieren als nicht-transportierbare Inhibitoren und hemmen somit die Wiederaufnahme von exozytotisch freigesetzten Monoaminen. Amphetamin-artige Stimulanzien kehren die Transportrichtung von DAT, NET und SERT um, wodurch eine nicht-exozytotische Freisetzung von Monoaminen ausgelöst wird. Zusätzlich gelangen Amphetaminartige Substanzen als Substrate von DAT, NET und SERT in das Zytosol und können somit in einigen Fällen die vesikulären Monoaminspeicher depletieren, womit potentielle neurotoxische Effekte assoziiert sind. Daraus resultierend ergibt sich die Notwendigkeit, die Wirkung von stimulierend wirkenden NPS an DAT, NET und SERT zu entschlüsseln. Während meiner Dissertation wurde der Frage nachgegangen, ob -analog der Phase 1 Metaboliten von MDMA- die Phase I Metaboliten von 4-Methylmethcathinon (Mephedron) psychoaktive Eigenschaften besitzen und somit zu den subjektiven Effekten von Mephedron betragen könnten. Mephedron erlangte als „Badesalz“ Berühmtheit und wird Gegenwärtig als MDMA-Alternative konsumiert. Experimente mit radioaktiv markierten Substraten von Monoamintransportern konnten zeigen, dass die Phase 1 Metaboliten von Mephedron mit DAT, NET und SERT interagieren und als Amphetamin-artige Substanzen eine nicht-exozytotische Freisetzung von Monoaminen bewirken. Mittels in vivo Studien in Ratten konnte ein Metabolit identifiziert werden, welcher nach systemischer Administration Dopamin und Serotonin im zentralen Nervensystem freisetzt und eine Steigerung der basalen Bewegungsaktivität auslöst. Weitere Studien sind geplant, um die Pharmakokinetik von Mephedron und den zugehörigen Metaboliten im zentralen Nervensystem und Blutplasma zu entschlüsseln, sodass die Kontribution der Metaboliten zu den zentralen Effekten von Mephedron abgeschätzt werden kann. Die zweite Studie, welche in diese Dissertation eingebettet wurde, enthält eine pharmakologische Charakterisierung der NPS-Fluorophenmetrazin (3-FPM) und der Stellungsisomere 2- und 4-FPM, welche Abkömmlinge der psychoaktiven Substanz Phenmetrazin darstellen. 2-, 3- und 4-FPM konnten als Amphetamin-artige Substanz - und somit als Substrat - von DAT, NET und SERT identifiziert werden. Die ausgeprägte Affinität zu DAT und NET suggeriert Missbrauchs- und Abhängigkeitspotential dieser Substanzen. Die eingebetteten Manuskripte offenbaren, dass die Wirkung von Mephedron durch die Phase 1 Metaboliten beeinflusst werden könnte und beinhalten eine pharmakologische Charakterisierung von Substanzen, welche gegenwärtig konsumiert werden (3-FPM) oder zukünftig auf den Drogenmärkten auftauchen könnten (2- und 4-FPM). Weiterst können die angewandten Techniken als Richtlinie betrachtet werden, um die Wirkung von NPS an Monoamintransportern zu entschlüsseln.Psychostimulant abuse constitutes a growing problem on a global scale, with no effective treatments for psychostimulant addiction being available at present. In addition to well-characterized and regulated stimulants, such as cocaine or 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA, “ecstasy”), the drug markets are flooded with new psychoactive substances (NPS). NPS are often referred to as “bath salts” or “research chemicals” and are sold as legal alternatives to scheduled substances. Due to chemical modifications, NPS bypass regulations and result in an overwhelming variety of substances with unknown pharmacology. The rewarding, stimulating and addictive properties of psychostimulants arise from their ability to elevate the extracellular concentrations of the monoamines dopamine, norepinephrine and serotonin. This is achieved by disrupting the function of the transporters for dopamine (DAT), norepinephrine (NET) and serotonin (SERT). Under physiological conditions, DAT, NET and SERT mediate the reuptake of exocytically-released monoamines and tightly regulate the strength of monoaminergic signaling. Despite similarities in their ability to enhance monoaminergic transmission, psychostimulants differ in their specific mechanisms of action. Cocaine-like drugs act as non-transported inhibitors, whereas amphetaminelike releasers, including some types of NPS, cause efflux of monoamines through the transporters. Furthermore, releasers act as substrates of DAT, NET and SERT and gain access to the cytosol. In the cytosol, releasers may disrupt the vesicular storage pools of monoamines and can exert neurotoxic effects. Thus, understanding how NPS act on DAT, NET and SERT is crucial to establishing the mechanism of action of this new class of compounds. During my thesis, I tested whether the phase 1 metabolites of 4-methylmethcathinone (mephedrone) possess sychoactive properties similar to the phase 1 metabolites of MDMA, and thus might contribute to the effects of mephedrone. Mephedrone became famous as part of the group of compounds called “bath salts” and is still abused as an alternative to MDMA. Results obtained from radiotracer-flux experiments showed that the phase 1 etabolites of mephedrone act as releasers at DAT, NET and SERT. In vivo studies in rats identified one metabolite that elevated extracellular dopamine and serotonin in the Nucleus accumbens and triggered locomotion upon systemic administration. Future studies shall investigate the pharmacokinetics of mephedrone and its metabolites in brain and plasma to estimate the overall contribution of the metabolites to the effects of mephedrone. The second study embedded in this thesis provides a pharmacological characterization of the NPS 3-fluorophenmetrazine (3-FPM) and its positional isomers 2-FPM and 4-FPM. The chemical structure of 3-FPM is based on the scheduled drug phenmetrazine. 2-, 3- and 4-FPM were identified as releasers at DAT, NET and SERT. The marked affinity of each FPM at DAT and NET suggests addictive properties and enhanced likelihood for abuse. In conclusion, the projects embedded in this thesis reveal that the metabolites of mephedrone might contribute to the overall-effects of mephedrone in vivo and provide a pharmacological characterization of potential future drugs of abuse. Further, the techniques applied herein may serve as a guideline for unraveling the mode of action of psychostimulants at monoamine transporters.submitted by Felix Paul Anton Mayer, MScZusammenfassung in deutscher SpracheAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersMedizinische Universität, Dissertation, 2017OeB