Transmembrane anchors of the structural flavivirus proteins and their role in virus assembly and maturation

Flaviviren sind kleine umhüllte Viren mit zwei membranassoziierten Proteinen (prM/M und E), die den Zusammenbau von Viruspartikeln („Assembly“) im endoplasmatischen Retikulum (ER) koordinieren. Virionen mit prM-E Heterodimeren an der Virusoberfläche, knospen als nicht-infektiöse unreife Partikel in das ER. Dieser Prozess wird durch laterale Wechselwirkungen zwischen prM-E Oligomeren, sowie durch noch unbekannte Wechselwirkungen mit dem Kapsid vermittelt. Diese Partikel werden dann durch den Exozytose-Weg der Zelle transportiert. Während des Transportes wird prM durch die zelluläre Protease Furin im Trans-Golgi-Netzwerk gespalten. Diese Spaltung spielt für die Umwandlung des Virus in seine reife infektiöse Form eine essentielle Rolle. Nach der Reifungsspaltung von prM bleibt M mit dem Virion assoziiert, wohingegen der pr-Teil nach der Freisetzung aus der Zelle vom Partikel dissoziiert. Als Nebenprodukt des Virusassembly werden Kapsid-freie subvirale Partikel (SP) durch laterale prM-E Wechselwirkungen gebildet. Diese SP bestehen ausschließlich aus einer Lipidmembran und den darin verankerten prM-E Proteinen. Der Transport durch die Zelle, sowie die Reifung und Freisetzung von SPn erfolgen in gleicher Weise wie bei Virionen. In dieser Doktorarbeit untersuchten wir die Wechselwirkungen innerhalb und/oder zwischen den einzigartigen doppelten Transmembranankern von E und prM/M sowie der einzelnen Transmembran-Domäne (TMD) des Kapsidproteins (C) im Assembly- und Reifungsprozess des Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSME-Virus), einem der wichtigsten humanpathogenen Flaviviren. Dieses Virus ist eng verwandt mit den durch Stechmücken übertragenen Gelbfieber, Dengue, Zika, Japanische Enzephalitis (JE), und West Nil Viren. Die TMDn sind Überreste der Polyprotein-Prozessierung am ER und dienen als Stop-Transfersignale und interne Signalsequenzen. Unter Verwendung eines infektiösen Klons des FSME-Virus (TBEV) ersetzten wir die TMDn der Strukturproteine (E, prM/M, C) durch die homologen Elemente des verwandten JE-Virus (JEV) in unterschiedlichen Kombinationen. Dieser Ansatz sollte die Untersuchung von TMD-Interaktionen erlauben, ohne ihre Funktionen während der Prozessierung des Polyproteins zu beeinflussen. Zusätzliche Informationen wurden durch serielles Passagieren von ausgewählten Viren und der Identifizierung von kompensatorischen Mutationen erworben. Wir beobachteten, dass Wechselwirkungen zwischen TMDn von E zur effizienten Produktion und Freisetzung von infektiösen Viruspartikeln beitragen und damit an der Rekrutierung des Nukleokapsids beteiligt sein könnten. Störungen dieser Wechselwirkungen führten zur vermehrten Bildung von Kapsid-freien SP auf Kosten vollständiger Virionen. E TMD Interaktionen scheinen auch an der Umlagerung der Hüllproteine an der Virusoberfläche, die für die Virusreifung und Entstehung von infektiösen Viren entscheidend sind, beteiligt zu sein. Im Gegensatz dazu wurde keine Beteiligung von spezifischen Wechselwirkungen der TMD des C Proteins in diesen Prozessen nachgewiesen. Entgegen unserer Erwartungen führte der Austausch der TMDn von prM/M durch die entsprechenden Elemente von JE-Virus zur Beeinträchtigung der Proteinexpression. Das ist ein Hinweis darauf, dass diese Regionen bereits an essenziellen Interaktionen teilnehmen, die für Polyprotein-Synthese und/oder Prozessierung notwendig sind. Insgesamt liefern die in dieser Arbeit präsentierten Daten neue Einblicke in die verschiedenen Funktionen der TMDn der Strukturproteine während des Virusassembly- sowie des Reifungs-prozesses und erweitern damit das Verständnis ihrer Rolle im Lebenszyklus von Flaviviren.laviviruses are small enveloped viruses with two membrane-anchored proteins (prM/M, E) that orchestrate virus assembly in the endoplasmic reticulum (ER). Virions containing prM-E heterodimers bud as non-infectious immature particles into the ER. This process is executed by lateral interactions between multiple prM-E heterodimers and still unknown interactions with the nucleocapsid. These particles are then transported through the exocytic pathway of the cell. During this transit prM is cleaved by the cellular protease furin in the trans-Golgi network, which is necessary for the conversion of the virus into its mature infectious form. After the maturation cleavage of prM, M remains associated with the virion, and the pr part disassociates upon secretion from the cell. As a byproduct of virus assembly, capsid-less subviral particles (SPs) containing only prM-E anchored in a lipid membrane are formed by lateral prM-E interactions. Cell transit, maturation and egress of SPs occur in the same manner as for virions. In this PhD thesis, we studied the interactions within and/or between the unique double transmembrane anchors of E and prM/M as well as the single transmembrane domain (TMD) of the capsid protein (C) in the assembly as well as maturation processes of one of the major human pathogenic flaviviruses, tick-borne-encephalitis (TBE) virus. This virus is closely related to the mosquito-borne yellow fever, dengue, Zika, Japanese encephalitis (JE), and West Nile viruses. The TMDs are remnants of polyprotein processing at the ER and function as stop-transfer signals as well as internal signal sequences. Using an infectious clone of TBE virus (TBEV) we replaced the TMDs of the structural proteins (E, prM/M, C) by the homologous counterparts of the related JE virus (JEV) in different combinations. This approach should have allowed the investigation of TMD interactions without affecting their functions in polyprotein processing. Further information was acquired by serial passaging of selected viruses and the identification of compensatory mutations. We found that contacts involving the TMDs of E are necessary for efficient morphogenesis and secretion of infectious virions and might contribute to the recruitment of the viral capsid. Disturbances of these TMD interactions favored the generation of capsid-less SPs at the cost of whole virus particles. E TMD interactions also seem to be crucial for the reorganization of the virus surface during virus maturation and the morphogenesis of infectious virions. In contrast, an involvement of specific interactions of the TMD of the C protein in these processes was not identified. Unexpectedly, the replacement of the TMDs of prM/M by their counterpart of JE virus impaired protein expression suggesting that these regions are already involved in crucial interactions necessary for polyprotein synthesis and/or processing. Overall the data presented in this PhD thesis provide new insights into the various functions of the TMDs of the structural proteins in assembly as well as maturation and thus extend previous knowledge of their roles in the life cycle of flaviviruses.submitted by Mag. rer. nat. Janja BlazevicZusammenfassung in deutscher SpracheAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersMedizinische Universität Wien, Dissertation, 2016OeBB(VLID)192329