The versatile role played by lysine deacetylase inhibitors in cancer-specific pathways and cell proliferation

Lysin-Acetyltransferasen (KATs) und Lysin-Deacetylasen (KDACs) sind vielseitige Enzyme, welche den Acetylierungsstatus von Histonen und anderen Proteinen regulieren. KDACs werden in verschiedenen Krebsarten überexprimiert, und ihre Hemmung kann zu Differenzierung und Apoptose der Krebszellen führen. Diese Wirkungsweise wurde für zahlreiche Krankheitsbilder wie Blutkrebs, soliden Tumoren oder viralen Infektionen nachgewiesen, wobei die bisher größte medizinische Verbesserung in der Behandlung von Blutkrebs erzielt wurde. Der therapeutische Einsatz von KDAC Inhibitoren (KDACi) ist von der FDA nur bei T-Zell Lymphomen und Multiplem Myelom als Einzel- beziehungsweise Kombinationstherapie zugelassen. Trotzdem zeigen neue Forschungsergebnisse vielversprechende Resultate für den Einsatz von KDACi bei weiteren Erkrankungen (zum Beispiel bei kardiovaskulären, neurodegenerativen Erkrankungen und Infektionskrankheiten). Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt darauf, unter verschiedenen Gesichtspunkten zu erforschen wie KDACi krebsspezifische Signaltransduktionswege beeinflussen können; mit besonderem Fokus auf Proteine, die in der Zellproliferation eine wichtige Rolle spielen. Um die frühe Reaktion auf eine KDACi Behandlung zu untersuchen, wurde ein systembiologischer Ansatz gewählt. Diese Herangehensweise stellt den Fokus auf unmittelbar betroffene Signaltransduktionswege sicher, und vermeidet die Auslösung zahlreicher sekundärer effekte durch Apoptose. Dadurch konnten Proteine identifiziert werden, die als Folge einer KDACi Behandlung ihre Expression und ihren Acetylierungsstatus verändern. Des Weiteren kann durch die Korrelation der Differenzen in Gen- und Proteinexpression auf eine spezifische Wechselwirkung geschlossen werden. Unsere Ergebnisse zeigen den Einfluss von KDACi auf Energiemetabolismus und mit Nukleotidsynthese in Zusammenhang stehende Signaltransduktionswege bereits bei geringer, nicht-apoptotischer Dosis. Diese Resultate umfassen unter anderem auch Proteine, die essentiell für das Überleben von Zellen sind. Die Gesamtheit der Daten wird im Überblick in Manuskript #1 erörtert. Die weiterführende Diskussion und der Ausblick dieser Arbeit beschäftigen sich vor allem mit krebsspezifischen Stoffwechselwegen und dem Potential, das die Erforschung eines durch KDACi beeinflussten Acetylierungsprofils in der Krebstherapie besitzt. Wir untersuchten den Einfluss der veränderten Acetylierung von MTHFD1 und SHMT2 auf Proteinstruktur, Oligomerisationsfähigkeit und Enzymfunktion. Eine Modifikation von Lysinresten durch Acetylierung wurde sowohl bei Histonen, als auch bei anderen Proteinen festgestellt. Zur Analyse der Histonacetylierung musste der übliche auf Massenspektrometrie (MS) basierende experimentelle Ansatz jedoch angepasst werden. Dem liegen insbesondere proteinchemische Unterschiede zugrunde, wie zum Beispiel Länge und Sequenz der betroffenen Peptide. Zu diesem Zweck entwickelten wir die FASIL-MS Strategie, die es uns ermöglichte, durch KDACi Behandlung hervorgerufene Lysinacetylierung positionsspezifisch auf Histonen zu quantifizieren. FASIL-MS kombiniert ein effizientes Probenvorbereitungsprotokoll und eine adaptierte MS Methode mit einer verbesserten bioinformatischen Auswertung der MS2-basierten Quantifizierung der Histonacetylierung. Dies kann zur Untersuchung weiterer experimenteller Fragestellungen herangezogen werden, beispielsweise zur Beobachtung von Veränderungen der Histonacetylierung in Abhängigkeit von Behandlungszeitpunkt, -dauer, oder Art des Inhibitors. Nach unserem Wissen stellt diese Arbeit die bisher umfassendste Strategie zur Erforschung der durch KDACi Behandlung ausgelösten quantitativen Änderungen in Gen- und Proteinexpression, Histon- und sonstiger Proteinacetylierung dar. Eine Kombination mit weiteren Methoden zur Untersuchung von Differenzen im Acetylierungsprofil wird zweifelsohne neue Einblicke in Alternativen für die zielgerichtete Krebstherapie gewähren.Lysine acetyl transferases (KATs) and lysine deacetylases (KDACs) are versatile enzymes that regulate the acetylation state of histone and non-histone proteins. KDACs are overexpressed in various types of cancer, and the inhibition thereof results in differentiation and apoptosis of tumour cells. This effect has been investigated in numerous diseases ranging from blood malignancies and solid tumours to viral infections. To date, however, the greatest medical benefits were observed in the treatment of blood cancer. KDAC inhibitor (KDACi) treatment is FDA-approved only for T cell lymphoma and multiple myeloma as a single agent or as a combinatorial therapy, respectively. Nevertheless, recent research shows promising results in extending the application of KDACis beyond blood malignancies to cardiovascular diseases, various inflammatory and neurodegenerative disorders. This thesis focuses on several aspects to investigate how KDACis influence cancer-specific pathways, particularly proteins associated with cell proliferation. The systems-biology approach was utilised to investigate an early response to KDACis in order to focus on the initial pathways that are altered after KDACi treatment, without triggering a plethora of secondary apoptotic events. This enabled identification of the proteins that are altered in expression and acetylation after KDACi treatment. Moreover, correlation of altered gene and protein expression denoted KDACi-specific modes-of-action. Our results revealed that the energy metabolism and nucleotide synthesis-related pathways are affected even under mild, non-apoptotic drug treatment. These also included proteins that are essential for cell survival. In manuscript #1, the global data is debated. Additional discussion and the future perspectives of this thesis focus on cancer-specific metabolic pathways, and the potential of exploiting KDACi-mediated acetylation changes to examine novel therapeutic strategies. To this end, the influence of altered acetylation of MTHFD1 and SHMT2 was investigated in the context of protein structure, oligomerisation potential, and enzyme function. Modification of lysine residues by acetylation has been identified on both histone and non-histone proteins. The analysis of altered histone acetylation, however, requires adaptation of the mass spectrometry-based (MS) approaches compared to analysis of non-histone protein acetylation. This is mostly due to differences in protein chemistry, i.e., length and sequence of the modified peptides. To this end, our FASIL-MS approach was developed to quantitate histone site-specific lysine acetylation mediated by KDACi treatment. FASIL-MS combines a streamlined sample preparation protocol, adjustment of the MS method and an improvement in the bioinformatic tool used for MS2-based quantitation of histone acetylation. This can be further employed in various experimental settings, such as monitoring drug- or time-dependent alterations in histone acetylation. Moreover, a combination of FASIL-MS with chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) can be utilised to localise certain acetylation changes at specific gene promoters. Multiple experimental approaches are needed to systematically assess the role of KDACis. To our knowledge, this thesis comprises the most comprehensive strategy to investigate the quantitative changes after KDACi treatment in gene and protein expression, together with altered histone and non-histone acetylation. A combination of these methods with additional tools to explore the function of acetylation changes will undoubtedly shed new light on alternative strategies for targeted cancer treatment.submitted by Dijana VitkoZusammenfassung in deutscher SpracheAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersMedizinische Universität Wien, Dissertation, 2017OeBB(VLID)220476