The GABAA receptor [alpha]+ [beta]- interface: a novel target for subtype selective drugs

GABAA [GABA tief A] Rezeptoren sind die bedeutendsten inhibitorischen Neurotransmitter Rezeptoren des zentralen Nervensystems. Durch die Bindung von GABA kommt es zur Öffnung des intrinsischen Chlorid Ionen Kanals, was zur Übertragung von schneller synaptischer Inhibierung führt. Der Rezeptor hat Bindungsstellen für eine große Anzahl von pharmakologisch wichtigen Substanzen, welche GABA induzierte Chloridströme modulieren können. Dies geschieht durch die Interaktion mit spezifischen und separaten Bindungsstellen am GABAA [GABA tief A]Rezeptor. Bis jetzt wurde an der extrazellulären Domäne des Rezeptors, neben den Bindungsstellen für GABA, nur die Bindungsstelle für Liganden an der Benzodiazepinbindungsstelle eindeutig bestimmt, die an der Schnittstelle der plus Seite der Alpha ([alpha]) und der minus Seite der Gamma ([gamma]) Untereinheit lokalisiert ist. Der Großteil der Substanzen die am GABAA [GABA tief A] Rezeptor aktiv sind, bindet jedoch an anderen Stellen als der Benzodiazepinbindungsstelle. Eine mögliche weitere Substanzbindungsstelle an der extrazellulären Domäne des Rezeptors könnte an der Schnittstelle zwischen der plus Seite der Alpha ([alpha]) und der minus Seite der Beta ([beta]) Untereinheit existieren. Diese Schnittstelle hat strukturelle Gemeinsamkeiten mit der Benzodiazepinbindungsstelle, nämlich die [alpha]+ Seite. In einer Testreihe von 95 neuartigen Substanzen an [alpha]1[beta]3 Rezeptoren konnten wir ein Pyrazoloquinolin, CGS 9895, als positiven-allosterischen Modulator identifizieren. CGS 9895 war in der Lage [alpha]1[beta]3 Rezeptoren und [alpha]1[beta]3[gamma]2 Rezeptoren gleichermaßen zu stimulieren. Weiters ist CGS 9895 ein allosterischer Antagonist an der Benzodiazepinbindungsstelle in [alpha]1[beta]3[gamma]2 Rezeptoren. Um die mögliche Bindungsstelle von CGS 9895 an der [alpha]+[beta]- Schnittstelle zu identifizieren, benutzten wir einen sogenannten "Steric-hindrance" Ansatz. Dabei werden einzelne Aminosäuren an der [alpha]+ oder [beta]- Seite in Cysteine mutiert, um sie mit einem Cystein-reaktiven Reagenz, Methanthiosulfanat Ethylamin (MTSEA-biotin) kovalent zu markieren. Dies führte zu einer Reduktion des CGS 9895 Effekts. Weiters konnten wir zeigen, dass der Effekt von CGS 9895 von den unterschiedlichen Subtypen der [alpha]- und [beta]-Untereinheiten abhängig ist. CGS 9895 repräsentiert einen Prototypen von Substanzen die ähnliche Effekte wie Benzodiazepine haben, obwohl sie an die [alpha]+[beta]- Schnittstelle des GABAA[GABA tief A] Rezeptor binden. Da diese [alpha]+[beta]- Schnittstelle in allen heteropentameren GABAA [GABA tief A] Rezeptoren präsent ist, werden solche Substanzen auch an [alpha][beta], [alpha][beta][gamma] und [alpha][beta][delta] Rezeptoren wirken. Die Wirkung solcher Substanzen wird jedoch eine weitaus breitere als die der Benzodiazepine sein, und deswegen könnten diese Substanzen auch eine klinische Relevanz für die Behandlung von Epilepsien bekommen.GABAA [GABA tief A] receptors are the major inhibitory neurotransmitter receptor in the central nervous system and mediate fast synaptic inhibition by opening an intrinsic chloride ion channel upon GABA binding. The receptor contains binding sites for a number of pharmacologically important drugs which modulate GABA induced chloride flux by interacting with separate and distinct allosteric binding sites. So far, in addition to the GABA binding site only the binding site for benzodiazepine site ligands, located at the interface formed by the plus side of the alpha ([alpha]) and the minus side of the gamma ([gamma]) subunit, has been unequivocally identified at the extracellular domain of the receptor but the majority of drugs showing effects at the GABAA [GABA tief A] receptor act via binding sites different from that of the benzodiazepines. One potential site of compound action at the extracellular domain of the receptor is the interface formed by the plus side of the alpha ([alpha]) and the minus side of the beta ([beta]) subunit. This interface shares common properties with the benzodiazepine binding site, namely the [alpha]+ side. In a screening of 95 newly synthesized benzodiazepine site ligands at [alpha]1[beta]3 receptors we identified the pyrazoloquinoline CGS 9895 as positive allosteric modulator. CGS 9895 was able to stimulate [alpha]1[beta]3 receptors to the same extent as [alpha]1[beta]3[gamma]2 receptors. But additionally acts as allosteric antagonist at the benzodiazepine binding site at [alpha]1[beta]3[gamma]2 receptors. To identify the possible drug interaction site of CGS 9895 at the [alpha]+[beta]- interface we made use of a so-called steric hindrance approach at which single amino acid residues at the [alpha]1+ and the [beta]3- side were mutated into cysteines. These cysteines were then covalently labelled with a cysteine reactive reagent, methanethiosulfonate ethylamine (MTSEA-biotin), which inhibited the CGS 9895 effect. We could further show that the CGS 9895 effect was dependent on different types of [alpha] and [beta] subunits. This suggested that CGS 9895 represents a prototype for drugs eliciting benzodiazepine like effects by a binding at the [alpha]+[beta]- interface of GABAA[GABA tief A] receptors. Since the [alpha]+[beta]- interface is present in all heteropentameric GABAA [GABA tief A] receptors, such drugs will show their action at [alpha][beta], [alpha][beta][gamma] and [alpha][beta][delta] receptors. The action of these drugs will thus be much broader than that of benzodiazepines and these drugs might become of clinical importance for the treatment of epilepsy.submitted by Joachim RamerstorferAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersJournal of Neuroscience (2011) Jan 19;31(3):870-7.Wien, Med. Univ., Diss., 2012OeBB(VLID)171655