Biophysical properties of neuronal nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) in the superior cervical ganglion of mice with deletions of distinct nAChR subunit genes

Neuronale nikotinische AcetylCholin Rezeptoren (nAChR) sind Liganden-aktivierte Ionenkanäle, die im Nervensystem weit verbreitet sind. Rezeptoren im Ganglion Cervicale Superius (SCG) setzen sich aus den Bausteinen ("Untereinheiten") alpha3, alpha5, alpha7, beta2 and beta4 zusammen. Von den insgesamt 12 bekannten Untereinheiten, die zum Aufbau von neuronalen Acetylcholin Rezeptoren beitragen (alpha2-alpha10 and beta2-beta4), wird somit im SCG nur ein Teil angetroffen. Während hetero-pentamere Nikotin-Rezeptoren (bestehend aus sowohl alpha wie beta Untereinheiten) die synaptische Übertragung im SCG vermitteln, ist die Funktion der homo-pentameren alpha7-Rezeptoren weitgehend ungeklärt. Sowohl die pharmakologischen als auch die biophysikalischen Eigenschaften von nikotinischen Acetylcholin Rezeptoren werden von den Untereinheiten bestimmt, aus denen die Rezeptoren aufgebaut sind. In ihrer Zusammensetzung definierte, neuronale Nikotinrezeptoren wurden bisher lediglich in heterologen Expressionssystemen untersucht. Da aber ihre Eigenschaften je nach Expressionssystem variieren, konnten diese Untersuchungen keine definitive Aussagen über Nikotinrezeptoren in Nervenzellen liefern. Ich wählte für meine Untersuchungen daher einen anderen Ansatz: Nervenzellen des SCG von transgenen Mäusen, bei denen sowohl die alpha5 als auch die beta2 Untereinheit ausgeschaltet wurden, exprimieren hetero-oligomere Rezeptoren, die lediglich aus den Untereinheiten alpha3 und beta4 aufgebaut sind. Rezeptoren von Mäusen, denen die alpha5 Untereinheiten fehlt, enthalten zusätzlich die beta2 Untereinheit (alpha3/beta4/beta2 mit 21%), wohingegen in beta2-Knockout Mäusen - neben alpha3 und beta4 - auch (zu 24%) alpha5-hältige Rezeptoren vorkommen (DAVID et al. 2010). Nach meinen Beobachtungen haben alpha3/beta4 Rezeptoren (in alpha5,beta2 doppel- and alpha5,beta2,alpha7 dreifach-KO Nervenzellen) eine dominierende Kanal-Leitfähigkeit von 32.6 0.8 pS und Kanal Öffnungszeiten, die bestmöglich an Exponentialfunktionen mit den Zeitkonstanten tau1 0.79 0.10 und tau2 8.99 0.55 ms angeglichen werden. In den meisten Messungen konnte ich - neben der dominierenden Leitfähigkeit - allerdings auch Kanalöffnungen mit etwas abweichender Amplitude beobachten. Neurone, in denen nur die alpha5 Untereinheit ausgeschaltet war, zeigten hingegen einen Rezeptor mit einer signifikant geringeren Kanal-Leitfähigkeit (13.6 0.5 pS) und geringfügig längeren Kanalöffnungszeiten (tau2: 25.4 3.9 ms). Auch alpha3/beta4/alpha5 Rezeptoren in beta2-KO Neuronen unterschieden sich durch längere Kanalöffnung (tau3 of 56.7 ms) und Bursts signifikant von alpha3/beta4 Rezeptoren. Basierend auf diesen Erkenntnissen konnte ich die 3 Rezeptoren alpha3/beta4, alpha3/beta4/alpha5, sowie alpha3/beta4/beta2 auch in Kontrollmäusen beobachten. Zusammenfassend ist meine Studie die erste dieser Art, in der Eigenschaften neuronaler Nikotinrezeptoren in ihrer natürlichen Umgebung - den Nervenzellen - beschrieben werden.Neuronal nicotinic AcetylCholine Receptors (nAChRs) are ligand-gated ion channels widely expressed in the central and peripheral nervous system. Out of twelve subunit-encoding genes (alpha2-alpha10 and beta2-beta4), autonomic ganglia express only the neuronal nAChR subunits alpha3, alpha5, alpha7, beta2 and beta4. The hetero-pentameric (alpha/beta pairs) receptors mediate fast synaptic transmission, whereas functions of ganglionic homo-pentameric (alpha7) receptors are still enigmatic. The biophysical properties of nAChRs are critically determined by their subunit composition. To date, single-channel properties of distinct neuronal nAChRs have only been studied in heterologous expression systems. However, these data have proven to be unreliable, since properties of recombinant receptors differ depending on the system where they are expressed. Here I used a different approach by taking advantage of transgenic animals. Hence, superior cervical ganglion (SCG) neurons from mice lacking both the alpha5 and the beta2 subunit express pure alpha3/beta4 hetero-oligomeric receptors, whereas single-KO animals missing the subunits alpha5 or beta2 express alpha3/beta4/beta2 (21%) and alpha3/beta4/alpha5 (24%), respectively, alongside with the more numerous (about 75%) alpha3/beta4 hetero-oligomeric receptors (DAVID et al. 2010). I found that alpha3/beta4 receptor channels (in alpha,5beta2 double- and alpha5,beta2,alpha7 triple-KO neurons) had a main unitary conductance of 32.6 0.8 pS and channel open times could be best fitted by a double-exponential function with time constants of 0.79 0.10 and 8.99 0.55 ms. In addition to the main channel conductance I observed secondary conductance levels in most of the patches. In alpha5 single-KO neurons, on the other hand, I characterized a new channel type with a significantly lower unitary conductance of 13.6 0.5 pS and a slightly longer channel open times (1.27 0.59 and 25.4 3.9 ms) than for alpha3/beta4 receptors. I attributed these properties to alpha3/beta4/beta2 receptors. Likewise, in beta2 single-KO patches I recognized channels that differed from alpha3/beta4 receptors by having significantly longer channel open times (indicated by a third time constant tau3 of 56.7 ms) and increased burst duration. Although the channel conductance of these receptors was identical to alpha3/beta4 receptors, these features suggest the presence of alpha3/beta4/alpha5 channels in the patch. After establishing single-channel properties in KO models I then recognized all these receptors in wild type animals as well. In sum, this is the first study revealing properties of distinct neuronal nAChRs in their native environment.submitted by Anna CiuraszkiewiczAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersZsfassung in dt. SpracheWien, Med. Univ., Diss., 2013OeBB(VLID)171594