Impaired excitatory synaptic input to spinal inhibitory interneurons in neuropathic pain

Pain is a central experience of most higher organisms. Despite its useful character as a warning symptom, that indicates tissue damage, it may become an independent disease on its own, when pain becomes chronic even in the absence of injury. Despite long-lasting efforts of investigation it still poses an unsolved problem in modern medicine. The spinal cord dorsal horn, particularly laminae I and II of the spinal cord grey matter, is an important modulatory site of incoming nociceptive information to the central nervous system (CNS). Here, incoming nociceptive fibres relay onto second order neurons that further propagate the sensory information to the brain, where pain sensation is evoked and linked to emotional and autonomic regulatory brain regions. But at that crucial step of pain processing, neuronal information is not simply propagated, but rather modulated by numerous mechanisms that either enhance or weaken the strength of the incoming signal. Among others, such as synaptic long term potentiation, descending inhibition, etc., spinal inhibitory interneurons play a pivotal role in that process. There is plenty of evidence from literature that a malfunction of this important regulatory system may cause exaggerated pain states as seen in patients with neuropathic pain. However, the underlying cellular mechanisms are yet not fully understood. In the spinal cord dorsal horn, GABAergic neurons cannot be identified by simple inspection. Here we took advantage in the use of transgenic mice expressing EGFP in their spinal GABAergic inhibitory neurons. This allowed us to identify inhibitory spinal neurons via epifluorescence microscopy. Chronic constriction injury (CCI) was used as a model of peripheral neuropathy. Group comparisons between CCI-treated and sham-operated animals were performed. We asked the question, if the excitatory synaptic input to spinal GABAergic inhibitory neurons was impaired in neuropathy. In CCI-treated mice we found a significant reduction of excitatory drive towards these neurons indicated by a reduced frequency of miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs). When introducing the Ca2+ chelator BAPTA intracellularly mEPSC-frequencies returned to normal indicating that this phenomenon was induced postsynaptically in GABAergic neurons via a rise of intracellular Ca2+ concentration. Paired-pulse recordings from GABAergic neurons following electrical dorsal root stimulation revealed an increase of paired-pulse ratio recorded in neuropathic animals. This displays a reduced release probability of neurotransmitters. Again, intracellular introduction of BAPTA in GABAergic neurons led to a normalization of paired-pulse ratios. On the other hand, no morphological changes of GABAergic neurons and no change of excitatory synapse count on GABAergic neurons could be detected when neurons were imaged via two-photon laser-scanning microscopy and confocal microscopy. These findings indicate that neuropathy induces postsynaptically a decrease of excitatory drive to inhibitory GABAergic neurons, which is expressed presynaptically. The retrograde signal responsible for this phenomenon remains unknown, since none of the tested molecules (endocannabinoids, nitric oxide, GABA, cannabinoid receptor blocker) proved to mimic or block that effect. Further on we show via immunohistochemical c-Fos detection that a reduced excitatory drive to GABAergic neurons correlates with less activation of these neurons. In this study we revealed a mechanism that may (along with other neuroplasticity changes) be responsible for exaggerated pain states following neuronal damage in animals and perhaps also human patients. Improvements in understanding the nature of how chronic pain diseases arise, elucidating their cellular and molecular mechanisms, may help to find new treatment strategies against chronic pain.Schmerz ist eine zentrale Erfahrung der meisten höheren Organsimen. Normalerweise ist er ein nützliches Warnsignal, das auf einen Gewebeschaden hinweist. Wenn sich Schmerz jedoch verselbständigt und ohne Gewebeschaden auftritt, wird er zu einem eigenständigen Krankheitsbild. Trotz intensiver wissenschaftlicher Forschung stellt chronischer Schmerz nach wie vor ein Problem der modernen Medizin dar. Eine entscheidende Umschaltstelle für eingehende nozizeptive Information in das Zentralnervensystem (ZNS) ist das Hinterhorn des Rückenmarks, insbesondere Laminae I und II seiner grauen Substanz. Nozizeptive Afferenzen bilden an dieser Stelle Synapsen mit Neuronen zweiter Ordnung, die nozizeptive Information ins Gehirn weiterleiten, wo das Schmerzempfinden ausgelöst und in emotionale und vegetative Regulationszentren des Gehirns integriert wird. An dieser entscheidenden Stelle der Schmerzverarbeitung wird nozizeptive Information jedoch nicht nur weitergeleitet, sondern auch durch verschiedenste Mechanismen moduliert, welche die eingehenden Signale verstärken oder abschwächen. GABAerge Neurone spielen dabei unter anderen (wie zum Beispiel synaptische Langzeitpotenzierung, absteigende Hemmung, usw.) eine entscheidende Rolle. Die wissenschaftliche Literatur lieferte bereits Hinweise, dass eine Fehlfunktion dieses wichtigen hemmenden Systems Zustände verstärkter Schmerzwahrnehmung auslösen kann, wie sie beispielsweise bei Patienten mit neuropathischem Schmerz zu beobachten sind. GABAerge Neurone des Rückenmarks können nicht einfach durch Inspektion identifiziert werden. In dieser Studie nutzten wir transgene Mäuse, die den Fluoreszenzfarbstoff EGFP in ihren GABAergen Neuronen exprimieren. Das ermöglichte die Identifizierung spinaler GABAerger Neurone mittels Epifluoreszenzmikroskopie. Als experimentelles Tiermodell für periphere Neuropathie wurde "chronic constriction injury" (CCI) verwendet. Zwischen CCI-behandelten und schein-operierten Versuchstieren wurden Gruppenvergleiche durchgeführt. Wir untersuchten, ob der erregende synaptische Eingang zu hemmenden GABAergen Neuronen durch Neuropathie gestört ist. Bei CCI-behandelten Mäusen fanden wir eine signifikante Reduktion des erregenden Zustroms zu diesen Neuronen anhand einer reduzierten Frequenz der mEPSCs (miniature excitatory postsynaptic currents). Durch das intrazelluläre Hinzufügen des Ca2+-Chelators BAPTA normalisierte sich die mEPSC-Frequenz, was darauf hinweist, dass dieses Phänomen postsynaptisch in GABAergen Neuronen durch eine intrazelluläre Erhöhung der Ca2+-Ionenkonzentration ausgelöst wird. Paired-pulse Aufzeichnungen von GABAergen Neuronen nach elektrischer Stimulation der Hinterwurzel zeigten einen Anstieg der paired-pulse Ratio bei neuropathischen Versuchstieren. Das weist auf eine Reduktion der Freisetzungswahrscheinlichkeit von erregenden Neurotransmittern hin. Auch bei diesen Experimenten führte die intrazelluläre Applikation von BAPTA zu einer Normalisierung der paired-pulse Messungen. Andererseits konnten weder morphologische Veränderungen der GABAergen Neurone selbst noch Änderungen der Zahl erregender Synapsen an GABAergen Neuronen durch Zuhilfenahme von Zwei-Photonen Laser-Scanning Mikroskopie und konfokaler Mikroskopie festgestellt werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Neuropathie eine Abnahme des erregenden synaptischen Zustroms zu hemmenden GABAergen Neuronen verursacht, der postsynaptisch ausgelöst und präsynaptisch exprimiert wird. Das für dieses Phänomen verantwortliche retrograde Signal blieb unbekannt, da keine der untersuchten Substanzen (Endocannabinoide, Stickstoffmonoxid, GABA) diesen Effekt nachahmen oder blocken konnte. Des Weiteren konnten wir mittels immunhistochemischer Färbungen von c-Fos zeigen, dass der reduzierte erregende Zustrom zu GABAergen Neuronen mit einer geringeren Aktivierung dieser Neurone korreliert. In unserer Arbeit untersuchten wir einen Mechanismus, der gemeinsam mit anderen neuroplastischen Veränderungen für gesteigerte Schmerzwahrnehmung nach einem Nervenschaden verantwortlich sein könnte. Die Aufklärung der den chronischen Schmerzkrankheiten zugrundeliegenden zellulären und molekularen Mechanismen führt zu einer Verbesserung des Verständnisses dieser Krankheiten und könnte zur Entwicklung neuer Behandlungsstrategien gegen chronische Schmerzen beitragen.submitted by Jörg LeitnerAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersZsfassung in dt. SpracheWien, Med. Univ., Diss., 2015OeBB(VLID)171564