The mechanism of interaction of local anesthetic drugs with voltage-gated sodium channels

Spannungsabhängige Natriumkanäle (VGSCs) ermöglichen die Auslösung und Weiterleitung von Aktionspotentialen in erregbaren Zellen. Unterschiedliche Isoformen von VGSCs sind in einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Vorgängen involviert. Daher stellen diese Moleküle wichtige Zielstrukturen für die Entwicklung von Pharmaka dar. Lokalanästhetika (LAs) sind bekannte Blocker von VGSCs mit einem komplexen Wirkmechanismus. Nach einer Depolarisation der Zellmembran entwickeln VGSCs eine Reihe unterschiedlicher inaktivierter Zustände. LAs können sowohl an schnelle inaktivierte Zuständen als auch an langsam inaktivierte Zustände binden. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Charakteristika der Bindung von LAs an unterschiedliche inaktivierte Zustände zu untersuchen. Methoden und Resultate: Im mittleren Anteil des S6 Segments der 4. Domäne des Skelettmuskelnatriumkanals (rNav1.4) wurden die nativen Aminosäuren seriell durch Cysteine ersetzt. Die Konstrukte wurden transient in tsA201 Zellen exprimiert und mit Hilfe der Patch Clamp Technik bezüglich des Zeitverlaufs der Erholung von langsamer und schnelle Inaktivierung untersucht. Der Zeitverlauf der Erholung von kurzen und langen inaktivierenden Präpulsen wies jeweils zwei bzw. drei exponentielle Phasen auf. Wir bezeichnen die diesen Erholungsphasen zugrunde liegenden inaktivierte Zustände jeweils als schnelle, intermediäre und langsame Inaktivierung (IF, IM and IS). Die durchgeführten Mutationen veränderten sowohl die relativen Amplituden als auch die Zeitkonstanten der Erholung von diesen Zuständen. Die Superfusion der Zellen mit dem LA Lidocain (LI) führte zu Veränderungen der jeweiligen Amplituden von IF, IM and IS welche spezifisch für die jeweiligen Mutationen waren. Nach kurzen Depolarisationen erhöhte LI die Amplitude einer Erholungsphase die ähnliche Charakteristika wie die Erholung von dem nativen IM Zustand hatte. Daher könnte LI zu einer Stabilisierung des IM Zustands führen. Jedoch konnte keine Korrelation zwischen den für die jeweiligen Mutationen spezifischen Eigenschaften des nativen IM Zustands und der jeweils durch LI modifizierten langsamen Inaktivierung festgestellt werden. Andererseits wurde eine solche Korrelation für die Erholungsphase nach langen Depolarisationen gefunden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass während kurzer Depolarisationen LI an den IF Zustand bindet und danach langsam abdissoziiert. Während langer Depolaristationen hingegen scheint LI an den IM Zustand zu binden und diesen zu stabilisieren. Die Mutation W1531G im der „P-Schleife“ der Domäne IV öffnet einen schnellen Zugangs- und Dissoziationsweg für LI vom bzw. in das extrazelluläre Medium. In dieser Mutante dissoziierte LI sehr schnell vom IF Zustand aber stabilisierte den IM Zustand während langer Depolarisationen. Schlussfolgerung: Während langer Depolarisationen erholen sich VGSCs von einem Minimum von drei inaktivierten Zuständen. Während kurzer Depolarisationen bindet LI an den schnellen inaktivierten Zustand und dissoziert danach langsam ab. Während langer Depolarisationen bindet LI an den intermediär inaktiviertem Zustand und stabilisiert denselben. Der Mechanismus der Bindung von LI hängt damit von der Dauer der Depolarisation ab.Mechanism of interaction of local anesthetics with voltage gated sodium channels. Introduction: Voltage gated sodium channels (VGSCs) are responsible for the initiation and propagation of action potentials in the excitable cells. Various isoforms of VGSCs are involved in the multiple physiological and pathophysiological processes. Thus, they are important molecular drug targets in the treatment of various diseases. Local anesthetics (LAs) are well-known inhibitors of VGSCs having complex mechanism of action. Upon depolarization VGSCs undergo multiple inactivated states. LAs bind with high affinity to the fast-inactivated state of VGSCs. However, the studies suggest that LAs also bind to slow inactivated state of VGSCs. Thus, the aim of our study is to understand the relative affinities of LAs to the fast and slow inactivated state of VGSCs. Methods and Results: Site directed mutagenesis was used to generate a serial cysteine replacement in the middle part (I1575C to Y1586C) of the S6 transmembrane segment of domain IV of the skeletal muscle isoform of VGSCs (rNav1.4). These mutations were tested with and without the application of lidocaine for the time course of recovery from fast and slow inactivation using whole cell patch clamp technique in transiently transfected tsA201 cells. The time course of recovery from short and from long depolarizations had two and three exponential phases, respectively. We refer to these states from which recovery occurs as fast, intermediate and slow inactivated states (IF, IM and IS). The introduced mutations produced alterations of both the amplitudes and the time constants of recovery from these states. Superfusion with lidocaine gave rise to mutation-specific alterations of the respective amplitudes of IF, IM and IS. Following short depolarizations lidocaine increased the amplitude of a recovery phase similar to native IM suggesting drug-induced stabilization of this state. However, there was no correlation between the mutation-induced alterations in the native IM and the respective lidocaine-induced slow recovery. On the other hand, analysis of lidocaine-induced modification of recovery from long depolarizations revealed a significant correlation between the lidocaine modulated IM state is and the native IM state. Thus, the results suggest that during IF state lidocaine binds to it and slowly dissociates from this state. During slow inactivation lidocaine binds to the IM state and stabilizes the same by reducing the fraction of channels entering into the IS state. An additional mutation (W1531G) resides in the p-loop of the channel and opens a rapid access and egress pathway for lidocaine. This construct was also tested to evaluate the dissociation and stabilization effect of lidocaine on IF and IM states respectively. In W1531G, lidocaine quickly dissociated during IF state, whereas during slow inactivation it stabilized the IM state by significantly reducing the fraction of the channels entering into the IS state. Conclusion: The study concludes that upon prolonged depolarization, VGSCs recover from minimum three inactivated states. During fast inactivation lidocaine binds to the fast-inactivated state and dissociates slowly from this state. However, during slow inactivation, lidocaine binds to intermediate inactivated state and stabilizes the same. Thus, the binding of lidocaine is mechanistically distinct in various inactivated states of VGSCs.submitted by Vaibhavkumar Shantaram GawaliAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersMedizinische Universität Wien, Dissertation, 2016OeBB(VLID)171463