Generation and characterisation of specific antibodies directed against subunits of nAChR and the biochemical properties of distinct nAChR in the superior cervical ganglion of mice with targeted deletions of nAChR subunit genes

Nicotinic acetylcholine receptors (nAChR) mediate fast synaptic transmission in ganglia of the autonomic nervous system. Their biophysical and pharmacological properties are critically determined by their subunit composition. nAChR can either be assembled as [alpha]7, [alpha]8 and [alpha]9 homopentamers or heteropentamers (different subunits). Preceding investigations from our laboratory have revealed the presence of mRNA coding for the nAChR subunits [alpha]3, [alpha]5, [alpha]7, [beta]2 and [beta]4 in the mouse superior cervical ganglion (SCG). In order to investigate the involvement of nAChR subunits in disease and their role in addiction to nicotine a variety of mice having targeted deletions of one (single knockout) or more of the five subunits (double/triple knockout) expressed in the SCG have been generated so far. These knockout animals are vital and show no obvious phenotype. Nevertheless these knockout (KO) animals would be excellent tools to investigate the distinct pharmacological properties of each nAChR type under native conditions if the exact subunit composition were known. Therefore the main aim of my studies is the investigation of the subunit composition of heteropentameric nAChR in the mouse SCG to accompany results of our laboratory from the 'pharmacological fingerprinting'. Subunit specific antibodies are essential prerequisites for the analysis of the subunit composition of nAChR subtypes. However, most of the commercially available antibodies give false positive results when tested on the tissue of KO animals and are therefore not suited for most common techniques, such as immunolocalisation (Moser et al. 2007). Therefore we generated subunit specific antibodies, extensively characterised on transfected HEK-293 cells, brain tissue and tissue collected from KO animals. With these antibodies immunoprecipitation (IP) experiments using [3H] labelled epibatidine, a highly specific agonist for heteropentameric nAChR, were performed to investigate the subunit composition in SCG of 18 day old C57/BL6 wild-type (WT) and KO mice. Results from IP show that the subunits [alpha]3 and [beta]4 are predominant subunits and [alpha]5 and [beta]2 are expressed as minor constituents. In WT, [alpha]5 single KO and [beta]2 single KO animals [alpha]3 and [beta]4 subunits are expressed in every functional receptor. Additionally the overall number of receptors in [alpha]5 single KO, [beta]2 single KO and [alpha]5[beta]2 double KO mice is not significantly different compared to WT. In contrast, [beta]4 single KO and [alpha]5[beta]4 double KO animals express significantly less nAChR (< 13 % of controls). The [beta]2 subunit is expressed in comparable levels in all animals (approximately 15 %) except in [beta]2 single and [alpha]5[beta]2 double KO animals. [alpha]5, however, is not expressed in nAChR in [beta]4 single KO animals. Therefore these animals express only [alpha]3[beta]2 nAChR. The [alpha]4 subunit is not expressed at all. Finally the IP data on the nAChR subunit composition of WT mice combined with mRNA data, IP data from KO mice and data from membrane receptor binding from WT and KO mice which indicates that nAChR subunits do not compensate for a missing subunit reveals the expression of the following nAChR in the SCG of WT mice: [alpha]3[beta]4 (55 %), [alpha]3[beta]4[alpha]5 (24 %) and [alpha]3[beta]4[beta]2 (21 %).Nikotinische Azetylcholin Rezeptoren (nAChR) medieren die schnelle synaptische Transmission in den Ganglien des vegetativen Nervensystems. Ihre biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften sind durch ihre Untereinheitenzusammensetzung bestimmt. nAChR assemblieren entweder zu [alpha]7, [alpha]8 und [alpha]9 Homopentameren oder zu Heteropentameren (Zusammensetzung aus verschiedenen Untereinheiten). Bei in unserem Labor durchgeführten Untersuchungen wurden mRNAs, welche für die nAChR Untereinheiten [alpha]3, [alpha]5, [alpha]7, [beta]2 and [beta]4 kodieren im Ganglion cervicale superius (SCG) der Maus detektiert. Um die Beteiligung von nAChR Untereinheiten in Krankheiten und die Beteiligung in der Nikotinsucht zu erforschen, wurden eine Reihe von Mäusen mit einer (einzel knockout) oder mehrerer (doppel/dreifach knockout) gezielter Deletionen einer oder mehrerer der fünf Untereinheiten, welche im SCG zu finden sind, hergestellt. Diese knockout Tiere sind vital und haben keinen offensichtlichen Phänotyp. Nichtsdestoweniger stellen diese knockout (KO) Tiere ein exzellentes Werkzeug dar, um die jeweiligen pharmakologischen Eigenschaften eines jeden Rezeptortypen unter nativen Konditionen zu testen, wenn die exakte Untereinheitenzusammensetzung bekannt ist. Aus diesem Grund ist das Ziel meiner Studien die Untersuchung der Untereinheitenzusammensetzung von heteropentameren nAChR im SCG der Maus, um die Ergebnisse des "pharmakologischen Fingerprinting" aus unserem Labor maßgeblich aufzuwerten. Untereinheitenspezifische Antikörper sind die Voraussertzung für die Analyse der Untereinheitenzusammensetzung von nAChR-Typen. Allerdings liefern die meisten kommerziell erwerbbaren Antikörper falsch-positive Ergebnisse, wenn diese mit Gewebe von KO Tieren getestet wurden und sind daher für die geläufigen Techniken (zB Immunolokalisationen) ungeeignet (Moser et al. 2007). Daher generierten wir untereinheitenspezifische Antikörper, welche wir umfassend mit transfizierten HEK-293 Zellen als auch Hirngewebe und SCG Gewebe von KO Tieren charakterisierten. Mit diesen Antikörpern wurden Immunopräzipitationen (IP) mit [3H] markiertem Epibatidin (ein hoch spezifischer Agonist für heteropentamere nAChR) durchgeführt um die Untereinheitenzusammensetzung im SCG von 18 Tage alten C57/BL6 Wild-Typ (WT) und KO Mäusen zu untersuchen. Gemäß der Ergebnisse der IP sind [alpha]3 und [beta]4 die vorherschenden Untereinheiten wogegen [alpha]5 und [beta]2 geringfügig exprimiert sind. In WT, [alpha]5 einzel KO und [beta]2 einzel KO Tieren sind [alpha]3 und [beta]4 Untereinheiten in jedem funktionellen Rezeptor exprimiert. Zusätzlich dazu ist die Anzahl der Rezeptoren in [alpha]5 einzel KO, [beta]2 einzel KO und [alpha]5[beta]2 doppel KO Mäusen nicht signifikant anders als in WT Tieren, wogegen [beta]4 einzel KO und [alpha]5[beta]4 doppel KO Tiere signifikant weniger nAChR haben (< 13 % der Kontrolle). Die [beta]2 Untereinheit ist in allen Tieren in vergleichbaren Mengen exprimiert (in etwa 15 %), außer in [beta]2 einzel und [alpha]5[beta]2 doppel KO Tieren. Interessanterweise ist [alpha]5 in den nAChR der [beta]4 einzel KO Tiere nicht exprimiert, weshalb diese Tiere ausschließlich [alpha]3[beta]2 nAChR haben. Die [alpha]4 Untereinheit wird nie exprimiert. Die IP Daten über die nAChR Untereinheitenzusammensetzung von WT Mäusen in Kombination mit den früheren mRNA Daten, die IP Daten von den KO Mäusen als auch die Erkenntnisse der Membranrezeptorbindungsstudien von WT und KO Mäusen, welche darauf hindeuten, dass nAChR Untereinheiten den Verlust einer anderen Untereinheit nicht kompensieren führen alle zu der Erkenntnis, dass die folgenden nAChR im SCG von WT Mäusen zu finden sind: [alpha]3[beta]4 (55 %), [alpha]3[beta]4[alpha]5 (24 %) and [alpha]3[beta]4[beta]2 (21 %).submitted by Reinhard DavidAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersZsfassung in dt. SpracheWien, Med. Univ., Diss., 2011OeBB(VLID)171378