Cancer stem cell maintenance in prostate cancer

Hintergrund: Das Prostatakarzinom ist die häufigste Krebsart und die zweithäufigste krebsassoziierte Todesursache bei Männern. Die Erkrankung wurde aufgrund ihrer Abhängigkeit von mitogenen Signalen des Androgenrezeptors als hormonabhängig beschrieben. Der Großteil der Patienten, die am Prostatakarzinom erkranken, spricht daher auf antihormonale Therapiemodalitäten wie chemische Kastration an. Ein signifikanter Anteil der Patienten entwickelt jedoch kastrationsresistente Tumore, welche, trotz großer rezenter Fortschritte in der Behandlung dieser Erkrankung, mit einem mittleren Gesamtüberleben von rund 18 Monaten ab Diagnose mit unheilbarem und letztlich letalem Krankheitsverlauf verbunden sind. In den letzten Jahren konnten spezialisierte Zellklone innerhalb der intratumoralen Heterogenität von Prostatakarzinomen identifiziert werden, welche Fähigkeiten von Stammzellen wie hohes Proliferationspotential und Multipotenz aufweisen und als Krebsstammzellen bezeichnet werden. Mithilfe eines transgenen Mausmodelles und humanen Zelllinien des Prostatakarzinoms konnten wir im Zuge dieses Dissertationsprojektes eine differentielle Antwort von Prostatakarzinomstammzellen auf Hypoxie nachweisen, welche ihr Überleben zulasten von Proliferation per Deregulation der AKT/mTOR-Signaltransduktionsachse förderten. Methodologie: Das transgene, über t-Antigene des Simian Virus 40 getriebene, Modell der Mausprostata (TRAMP) wurde im Zuge dieser Studie als Quelle für primäre Prostatatumore verwendet. Zucht und Haltung erfolgten im biomedizinischen Zentrum unserer Institution. Einzelzellsuspensionen wurden per enzymatischem Gewebeverdau hergestellt und aus ihnen per Durchflusszytometrie stammzellartige Krebszellen isoliert. Intrazellulärer Proteinnachweis erfolgte ebenfalls mithilfe dieser Methode. Weiters wurden etablierte Prostatakarzinomzelllinien murinen und humanen Ursprungs unter standardisierten und sterilen Zellkulturbedingungen gehalten. Teile der Zellexperimente wurden in hypoxischem Milieu und unter pharamakologischer Beeinflussung von mTOR und HIF1[alpha]-Signalachsen durchgeführt. Weitere Experimentalistik umfasste klassische nukleomische und proteomische Nachweismethoden wie etwa PCR-Techniken und Western Blot. Zellviabilität wurde mittels MTT-Assays analysiert. Spheroidbildung wurde in aus Matrigel bestehenden Matrices durchgeführt und mittels Mikroskop manuell ausgewertet. Apoptose- und Viabilitätsuntersuchungen umfassten zudem AnnexinV-Assays, welche durchflusszytometrisch analysiert wurden. Xenografts wurden in NOD SCID Gamma-Mäusen durchgeführt. Alle Tierexperimente wurden unter Einhaltung tierethischer Richtlinien unserer Institution und nach positivem Votum der Tierethikkommission durchgeführt. Ergebnisse: Prostatakrebsstammzellen aus dem basalen Kompartment des Prostataepithels von primären TRAMP-Tumoren als auch aus humanen und murinen Zelllinien wurden auf Hochregulierung von klassischen krebsstimulierenden molekularen Signalwegen untersucht. Der Transskriptionsfaktor HIF1[alpha] zeigte sich in Krebsstammzellen - verglichen mit nicht-stammzellartigen Krebszellen - überexprimiert und zudem verstärkt stabilisiert. Ferner waren auch bekannte HIF-Zielgene in hypoxischen CSCs überexprimiert und eine durch HIF1[alpha] verursachte Überaktivierung von AKT konnte durch einen molekularen Mechanismus mittels mTOR/S6K/IRS-1-Feedbackloop nachgewiesen werden. Diese Deregulation des AKT/mTOR-Signalweges korrelierte zudem mit primärer Resistenz der stammzellartigen Krebszellen gegenüber pharmakologischer mTOR-Inhibition. Konklusion: Unsere Ergebnisse decken einen Krebsstammzellen inhärenten molekularen Mechanismus auf, welcher ihnen unter hypoxischen Bedingungen über Deregulation von AKT und mTOR einen Überlebensvorteil gegenüber umgebenden Zellen zulasten von Wachstum ermöglicht. Über diesen molekularen Schalter, so unsere abschließende Hypothese, besitzen Prostatakrebsstammzellen durch Senkung metabolischer und proliferativer Aktivität primäre Therapieresistenz gegenüber klassischen zytostatischen Therapieverfahren sowie pharmakologischer mTOR-Inhibition.Methods: Throughout this study, the transgene model of the mouse prostate (TRAMP) expressing Simian Virus 40 t-antigens was bred and used as source for prostatic tumor tissue. Creation of single cell suspensions was performed using enzymatical tissue dissociation. Isolation of prostate cancer stem cells and intracellular immunostaining was performed using flow cytometry cell sorting (FACS). Further, well established prostate cancer cell lines of human origin were cultivated and analyzed in vitro under sterile standard cell culture conditions. Further, cell experiments were partially performed under hypoxic conditions and pharmacological blockade of the Mammalian target of rapamycin (mTOR) and Hypoxia-inducible factor 1[alpha] (HIF1A/HIF1[alpha]). Experiments performed included classical nucleomic as well as proteomic approaches such as western blot or polymerase chain reaction (PCR). Cell viability was assessed using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assays. Spheroid formation assays were performed using matrigel and manual counting using a microscope. Viability of cells was assessed using AnnexinV stainings and FACS. Xenograft experiments were performed in NOD scid gamma (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice. All animal experiments were carried out in accordance to requirements set by our institutional animal ethics committee. Results Basal CSC populations isolated from primary TRAMP tumors as well as human and murine cell lines using FACS were investigated for upregulation of known cancer promoting pathways. HIF1[alpha] was found to be overly expressed in CSCs populations when compared to their non-CSC counterparts. Further, HIF target-gene expression was abundant in hypoxic CSCs, and upregulation of protein kinase B (AKT) activity occurred through a molecular mechanism consisting of an mTOR/S6K/IRS-1 feedback loop, directly promoting survival of CSCs via deactivation of AKT feedback inhibition. Further, resistance of prostate CSCs to selective mTOR inhibitors was seen because of HIF1[alpha] upregulation. Conclusion Looking at our results, we present a novel mechanism of prostate cancer stem cell maintenance under hypoxic conditions through deregulation of the PI3K/AKT/mTOR pathway via HIF1[alpha]. We further propose the newly discovered process to be vital for CSC quiescence and maintenance by reducing CSC metabolism and growth via mTOR and supporting survival by AKT. Also, we suggest a primary drug resistance of prostate CSCs towards mTOR inhibition as well as classical cytostatic therapies.submitted by Maximilian Marhold, MDZusammenfassung in deutscher SpracheMedizinische Universität Wien, Dissertation, 2016OeBB(VLID)161614